桃花中綠原酸抗氧化活性的研究△

梁萱，李嘉會，梁永鋒*

(1.蘭州軍區蘭州總醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏師范學院 化學化工學院，寧夏 固原 756000)

桃花Prunuspersica是薔薇科落葉喬木桃樹的花，是一種民間常用中藥。主治水腫，痰飲，腳氣，便秘，利水通便，癲狂，閉經，瘡疹等[1]。研究表明桃花中含有山奈酚、多糖、黃酮、綠原酸、維生素、蛋白質等多種對人體有益的活性成分[2-3]。綠原酸具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抑制癌細胞突變、抗腫瘤、保護心血管、降低血壓等藥理作用[4-5]。自由基是人體代謝的產物，主要以超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫自由基等形式存在于人體內，人體中過多的自由基會破壞細胞膜，使血清抗蛋白酶失去活性，損傷基因導致細胞變異的出現和蓄積。大量資料已經證明，炎癥，腫瘤、衰老、血液病、以及心、肝、肺、皮膚等100多種疾病的發生機理與體內自由基產生過多或清除自由基能力下降有著密切的關系[6-7]。用人工合成的抗氧化劑來消除體內的自由基和治療疾病，往往效果不佳，且產生毒副作用，因此，近年來關于中草藥的抗氧化活性研究越來越引起自由基醫學的重視[8-9]。但目前關于桃花提取物抗氧化活性的報道比較少，本實驗通過近年來普遍采用的中藥抗氧化活性評價方法DPPH自由基法， D-脫氧核糖-鐵體系法和鄰苯三酚自氧化法[10]對桃花提取物的抗氧化活性與其綠原酸含量的相關研究，為進一步研究桃花的藥理作用提供理論支撐。

1 實驗儀器與藥品

1.1 主要實驗儀器

FW-177中草藥粉碎機；LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津)；UV-1750型紫外分光光度計(日本島津)；XH300A微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司)；ME2358電子分析天平(德國塞多利斯公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮升華儀器廠)。

1.2 實驗藥品

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200413，質量分數99%)；桃花(采自于寧夏固原市原州區寧夏師范學院后山古雁嶺)，將新鮮的桃花用蒸餾水清洗后，瀝干，放入恒溫箱中，在60 ℃烘干至恒重，自然涼干，粉碎，過80目篩，作為實驗用樣品，備用。乙腈(色譜純)、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigme公司)、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸、鄰苯三酚、三氯乙酸、氫氧化鉀、無水乙醇、水楊酸、抗壞血酸、硫代巴比妥酸(TBA)、EDTA、乙酸乙酯、正己烷、FeCl3、H2O2、FeSO4等均為國內產分析純。

2 實驗方法

2.1 桃花中綠原酸的提取及含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.3%H3PO4水溶液(8∶92)為流動相；流速1.0 mL·min-1，保持30 ℃柱溫，進樣量10 μL，檢測波長331 nm。

2.1.2 標準曲線的建立 準確稱取經過干燥的綠原酸標準品2.0 mg，乙醇溶解并定容至100 mL，配制成20 μg·mL-1的綠原酸標準品儲備液。分別取1、2、5、10、15 μL標準品儲備液，在上述色譜條件下進行測定，以峰值面積值(Y)對綠原酸濃度(X)進行限行回歸，回歸方程為：Y=11 367.62X-374.93，r=0.999 4，表明綠原酸標準品在20～300 μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

2.1.3 桃花中綠原酸的提取及純化 根據單因素試驗和正交試驗的結果，稱取10 g經過預處理的桃花樣品于500 mL錐形瓶中，用200 mL 70%的乙醇浸潤30 min，在功率為70 W下超聲輻射75 min，過濾，將濾液收集，相同條件下再提取1次，將2次濾液合并。將濾液在60 ℃下減壓濃縮干燥，得到綠原酸粗提物0.499 6 g。將綠原酸粗品用蒸餾水完全溶解，用鹽酸調至pH值為3，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取，每次萃取10 min，連續萃取3次，合并萃取液上層，減壓濃縮至一定體積，按體積的40%加入正己烷，反復震蕩，將經過分相析出的綠原酸在0～4 ℃結晶24 h，并將其在95 Kpa，50 ℃進行真空干燥30 min，得到白色晶體綠原酸[11]，備用。

2.1.4 桃花提取的綠原酸含量的測定 準確稱取0.1 g桃花提取物綠原酸純化品，用70%的乙醇溶解并容至100 mL，配置成桃花提去物樣品溶液。取其樣品溶液1.00 mL，用乙醇稀釋定容至100 mL，按2.1.2方法測定。依據綠原酸標準曲線方程計算其濃度，按公式：綠原酸的含量(%)=桃花提取物樣品溶液的體積(mL)×根據標準曲線計算的濃度(μg·mL-1)×稀釋的倍數/桃花提取物質量(g)×100%，計算得到桃花提取物中綠原酸含量為89.37%。

2.2 桃花提取物還原能力的測定

采用普魯士蘭法。取2.5 mL的不同濃度桃花提取物樣品(空白用蒸餾水代替，其他試劑下同)溶液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1，pH=6.6)及1%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，于50 ℃水浴反應20 min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，取反應液5 mL。加入5 mL的H2O和0.10%的FeCl3溶液1 mL，混合均勻，10 min后于700 nm處測定其吸光度值[12]，以水為空白，吸光度值越大，還原能力越強。以相同濃度的綠原酸標準品和抗壞血酸作陽性對照實驗。

2.3 桃花提取物清除羥基自由基(·OH)的活性研究

采用D-脫氧核糖-鐵體系法。向干燥潔凈的試管中依次加入0.4 mL 50 mmol·L-1的KH2PO4-KOH緩沖液，一定濃度的桃花提取物樣品溶液，0.1 mL 1.04 mmol·L-1的EDTA溶液，0.1 mL 20 mmol·L-1的FeCl3溶液，0.1 mL10 mmol·L-1的H2O2， 0.1 mL 60 mmol·L-1的DR(其中對照不加)，0.1 mL 20 mmol·L-1的抗壞血酸，使反應體系最終體積為1 mL， 37 ℃下保溫1 h，取出迅速加入25%的鹽酸1 mL終止反應，再加入1 mL 1%的TBA，沸水煮沸15 min，立即冷卻，若有混濁加人3 mL正丁醇萃取，在532 nm下測其吸光度[13-14]，以相同濃度的綠原酸標準品和抗壞血酸作陽性對照實驗。清除率按以下公式計算：

(1)

其中A0：空白吸光度；A1：加入清除劑和DR 后吸光度；A2：樣品本身吸光度(不加DR)。

2.4 桃花提取物清除DPPH·自由基的活性研究

取不同濃度的桃花粗提物樣品溶液1 mL，向其中加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基無水乙醇溶液，常溫下黑暗處放置30 min，在517 nm下測得吸光值；以2 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液為空白組；2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH乙醇溶液與2 mL蒸餾水為對照組；同時以等體積蒸餾水和95%的乙醇混合液作為空白調零[15]。每個濃度重復實驗3次，取吸光度的平均值，用相同濃度的綠原酸標準品和抗壞血酸作陽性對照實驗。按下式計算DPPH自由基清除率：

(2)

式中A0：為對照組吸光度，Ay：為空白組吸光度，Ax：為加入桃花多糖后溶液的吸光度。

2.5 桃花提取物清除超氧陰離子的活性研究

(3)

3 實驗結果

3.1 桃花提取物的還原能力

稱取桃花提取物樣品20 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL，桃花提取物樣品的濃度為2 mg·mL-1，準確移去該溶液1 mL，分別稀釋10、25、40、100、200、400倍，使桃花提取物樣品的濃度分別為200、100、50、20、10、5 μg·mL-1。按2.2方法分別測定桃花提取物、綠原酸標準品和抗壞血酸的吸光度。用吸光度值的大小評價其還原能力，吸光度值越大還原能力越強。實驗結果如圖1所示。

圖1 Vc、綠原酸和桃花提取物還原能力

實驗結果表明，在實驗選取的濃度范圍內，Vc、桃花提取物和綠原酸對Fe3+具有還原能力，濃度小于20 μg·mL-1時還原能力均比較弱，但隨著濃度的增大其還原能力都迅速逐漸增強。且在濃度較低范圍內Vc的還原能力明顯大于桃花提取物和綠原酸標準品，當濃度大于100 μg·mL-1時，隨著還原能力都在增強的同時三者的還原能力逐漸接近。

3.2 桃花提取物對羥基(·OH)自由基抗氧化活性

按2.3方法分別測定濃度為5、10、20、50、100、200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標準品和Vc對D-脫氧核糖-鐵體系產生羥基自由基(·OH)的消除率，實驗結果如圖3所示。圖3表明，在5～200 μg·mL-1范圍內，桃花提取物、綠原酸和Vc對D-脫氧核糖-鐵體系產生的羥基(·OH)均有一定的抗氧化活性，相同濃度其抗氧化活性桃花提取物>綠原酸標準品>抗壞血酸。而且隨著濃度的增大，抗氧化活性增大，當濃度大于100 μg·mL-1抗氧化活性基本穩定，濃度為200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標準品和Vc的抗氧化活性分別為66.42%，49.92%和19.68%。同時發現桃花提取物和綠原酸標準品對羥基自由基(·OH)抗氧化活性變化趨勢一致。

圖3 Vc、綠原酸和桃花提取物對·OH自由基抗氧化活性

3.3 桃花提取物對DPPH·自由基抗氧化活性

按2.4方法分別測定濃度為5、10、20、50、100、200 μg·mL-1桃花提取物、綠原酸標準品和Vc對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)產生的自由基抗氧化活性，實驗結果如圖4所示。由圖4表明，在5～200 μg·mL-1范圍內，桃花提取物、綠原酸標準品和Vc三種物質對DPPH·自由基均具有強的抗氧化活性，隨著濃度的增大，其抗氧化活性增強。相同濃度下，桃花提取物、綠原酸標準品對DPPH·自由基的抗氧化活性均大于Vc，濃度為200 μg·mL-1時其抗氧化活性分別為82.12%、78.42%和74.65%，且桃花提取物對DPPH·自由基的抗氧化活性具有良好的效量關系。

圖4 Vc、綠原酸和桃花提取物對DPPH·自由基

3.4 桃花提取物對超氧陰離子的抗氧化活性

圖5 Vc、綠原酸和桃花提取物對自由基抗氧化活性

4 結論

本實驗采用體外化學模擬法對桃花綠原酸粗提物的抗氧化活性進行了探討，并以綠原酸標準品和抗壞血酸為對照，實驗表明桃花提取物對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有較強的抗氧化活性，并且與其濃度具有良好的效量關系，說明桃花中的抗氧化活性物質主要來源于綠源酸。

由于植物成分的復雜性，往往含有多種抗氧化活性成分，因此，不同的提取方法、溶劑和條件將使成分、含量不同，導致評價效果產生差異。

體外化學模擬法與人體的抗氧化環境有所差異，關于桃花綠原酸能否作為人體抗氧化活性物質還需要進一步的探討和進行大量的動物實驗及臨床試驗研究。

關于桃花綠原酸抗氧化機理、抗氧化活性的穩定性及桃花中其它抗氧化活性成分的協同作用需要繼續進行探索和研究。

本實驗只是對桃花提取物綠原酸的抗氧化活性進行了初步探索，若要提高其藥用價值和經濟價值還需要進行大量深入的研究，可以預見桃花在醫療和美容領域有著廣闊的應用前景。

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