UPLC-MS/MS測定人參花中5種內源植物激素含量△

陳康，劉娟，周修騰，紀瑞鋒，童宇茹，3，陳同，袁媛*

(1.道地藥材國家重點實驗室，中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫藥大學，合肥 230038；3.沈陽藥科大學 中藥學院，沈陽 110016)

人參花為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Meyer的干燥花蕾，具有補氣強身、抵抗疲勞、延緩衰老的作用[1]。研究表明，人參花中含有20多種皂苷活性物質、17種氨基酸、11種微量元素、3種抗癌活性蛋白、多種生物活性揮發油等[2-3]，具有藥品及保健品開發潛力；同時，人參主要活性成分人參皂苷在人參花中含量高達5%～7%，是人參根的5～6倍[4]，且從人參花中分離得到了多種具有生物活性的新穎結構人參皂苷[5-7]。近年來，隨著新藥源的拓展研究，有關于人參花的藥理、藥化、提取工藝報道越來越豐富，但尚未見到有關人參花的內源植物激素報道。

植物內源性激素是植物體內重要的信號分子，其分布具有明顯的組織特異性，對植物的生長發育有重要的調節控制作用。其中，生長素(如：IBA、IAA、NAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)參與了多個植物生長發育過程，如種子萌發、休眠、植物生長、開花、葉片衰老脫落等；茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)作為脅迫激素，受到生物脅迫和非生物脅迫的調控，增強植物的抗逆性，在植物的脅迫耐受性和抗性中發揮著重要作用[8-10]。研究表明，以上5種植物激素對藥用植物次生代謝調控均具有重要意義。其中IBA可以提高匍枝筋骨草β-脫皮甾酮的含量[11]，GA可以誘導丹參毛狀根酚酸類物質的積累[12]，ABA可以調控滇紫草細胞紫草寧生物合成[13]，JA與SA可促進白木香懸浮細胞的倍半萜生物合成[14-15]等。

植物激素對人參皂苷的合成具有重要的調控意義[16-18]，但有關人參內源性激素的研究較少，而在人參花中內源性植物激素的分布尚未見報道。本研究根據課題組前期建立的激素測定方法[19]，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜(UPLC-MS/MS)對人參花中5種內源性植物激素ABA、GA3、IAA、JA、SA進行測定，同時還對JA前體12-氧-二烯酸(OPDA)和JA活性形式JA-異亮氨酸(JA-ile)含量進行測量分析，旨在為揭示內源性植物激素對人參花中次生代謝的調控機制奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試人參幼苗，由康美新開河種植基地提供，經中國中醫科學院中藥資源中心黃璐琦研究員鑒定為人參PanaxginsengC.A.Mey.的幼苗。

1.2 儀器

AB Sciex公司QTRAP?6500三重四極桿質譜聯用分析系統；美國Thermo Scientific公司Millipore超純水系統；BT-224S型萬分之一電子分析天平；THZ-C-1全溫震蕩搖床；5810R高速冷凍離心機。

1.3 試劑

生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈、甲酸購自Fisher公司；其余試劑為國產分析純，超純水自制。

2 方法

2.1 激素提取方法

分別收集新鮮的人參花，液氮冰浴研磨，準確稱取根和葉片各0.1 g到5 mL離心管中，加入異丙醇：水：HCl(2∶1∶0.002)提取液1 mL，4 ℃，100 r·min-1搖床中振動30 min，取出離心管后加入2 mL二氯甲烷，再次振動30 min；4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心5 min，吸取有機相層溶液1.8 mL，氮氣吹干，加入50%甲醇-水溶液400 μL，4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心15 min，吸取上清液進行UPLC-MS/MS分析。

2.2 色譜-質譜條件

色譜條件：Waters ACQUITYUPLCBEH C18色譜柱(2.1 mm YUPLCB，1.71 mm)，流動相：0.05%甲酸水-乙腈溶液。線性洗脫梯度：0～0.3 min，10%乙腈；0.3～3 min，10%～60%乙腈；3～6 min，60%～95%乙腈；6～6.2 min，10%乙腈。流速為0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進樣量10 μL，分析時間7 min。

質譜條件：電離方式為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為負離子掃描；監測方式為多反應監測(MRM)；氣簾氣的壓力為30 psi，離子化電壓為-4500 V，離子源溫度550 ℃，噴霧氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，數據處理用MultiQuant定量軟件進行分析。

3 結果及分析

3.1 專屬性檢測

配置內源性植物激素標準溶液，按2.2項下的質譜-色譜條件進樣分析。結果表明，人參花的內源性植物激素峰型單一、分離度較高，且均在5 min以內出峰，實現了植物激素準確快速測定的目的，適用于人參花中激素含量的測定(見圖1)。

注：A：IBA標準品；B：GA3標準品；C：ABA標準品；D：人參花IBA樣品；E：人參花GA3樣品；F：人參花ABA樣品；G：SA標準品；H：JA-ile標準品；I：OPDA標準品；J：人參花SA樣品；K：人參花JA-ile樣品；L：人參花OPDA樣品。圖1 內源性植物激素選擇反應監測離子流圖

3.2 人參花中5種內源激素含量檢測及分析

本實驗對人參花中內源性植物激素含量進行分析，每種激素平行5個樣品。表1為人參花中5種內源性植物激素含量的檢測結果。由結果可以看出，人參花中含有較多抗逆激素SA與ABA，研究也表明水楊酸可以誘導植物開花、促進果實生長[20]，而ABA對植物成花的誘導和發育具有重要調控作用[21]；而與植物向性生長相關的IBA及伸長生長相關的GA3含量較低，研究表明植物中越是代謝旺盛的器官生長素與赤霉素含量越高，說明人參花的代謝速度較慢；而茉莉酸JA在人參花中含量極低(低于檢測限以下)，因此有必要對JA激素合成通路相關的前體及活性成分進行進一步檢測分析(圖2)。

表1 人參花中內源性植物激素含量

圖2 人參花5種內源性植物激素含量比例分析

3.3 人參花中JA合成通路關鍵成分的分析

JA生物合成通路主要分成三個階段：(1)在質體中，由甘油酯轉變為OPDA；(2)在過氧化物酶體中，OPDA轉變為茉莉酸(JA)；(3)在胞質溶膠中，JA轉變為活性形式的茉莉酸與異亮氨酸的偶聯物(JA-ile)(圖3)。JA在不同組織的差異性積累導致了特異性的基因調控效應[22]。在對模式植物擬南芥和番茄的研究中，JA被認為通過調控水運輸到花藥和花絲的過程來調控花藥的開裂和衰老，從而達到調控開花時間的作用[23-24]。在對水稻、小麥、黑麥和高粱等禾本科植物的研究中，同樣發現內源性JA也參與穎花開放的調控[25]。從我們的數據中可以看到存在大量的JA前體OPDA，這種現象既是為了可能的應激反應誘導大量JA信號提供物質基礎，同時也是開花期植物花中JA組成性表達的必然結果。JA及其衍生物主要的活性物質MeJA、JA-ile早就被證明是人參皂苷合成通路上非常有效的化學誘導子[26]，往往都是通過刺激合路上關鍵酶基因[27]或是調控信號轉導[28]。其中用外源100 μM MeJA處理人參不定根，參與人參皂苷生物合成基因如HMGR、SS、SE和DDS有明顯上調，而CAS略有下降[29]。我們的數據中JA和JA-ile的含量水平不高，考慮到激素本身作用就是具有級聯放大的作用效果，維持較低的濃度才是穩態。

圖3 人參花中JA合成通路含量分析

4 討論

內源性激素對于藥用植物的生長及次生代謝產物(多數為藥效成分)的含量具有重要的調控作用，植物內源性激素作為天然生長調節劑，參與了多種植物的生長發育過程并調控植物的次生代謝。

本研究發現，內源性植物激素可能參與調控了人參開花過程以及花中人參皂苷的積累。前人研究表明，內源性激素對植物開花過程存在調控[30-32]。ABA對刺梨Rosaroxburghii[33]、銀杏GinkgobilobaL.[34]、荔枝Litchichinensis[35]、蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrida)[36]等花的形成起促進作用[37]。2004年，Ulger 等的研究結果顯示在花誘導和起始階段高濃度的ABA對花的形成起促進作用[38]。中藥領域中，在石斛DendrobiumcandidumWall.ex Lindl.離體培養的研究中也發現，原球莖在ABA培養基上預處理15d再轉入MS培養基上培養，花芽形成頻率明顯提高，且單株花數增加[39]；同時，人參皂苷也在人參的花蕾中含量相對較高[40]，植物激素和人參花中皂苷合成和積累可能存在一定相關性：而SA和JA都對人參皂苷合成起到調控作用[41]。從內源性植物激素對中藥的次生代謝的影響來說，ABA促進黃花蒿中青蒿素的含量[42]，JA也對藥用植物次生代謝產生重要影響[43]。因此，內源性植物激素對人參的生長及次生代謝的調控影響值得深入討論，同時內源性植物激素對中藥質量的影響及具體機制的研究有待今后的進一步研究。

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