儲藏條件對柏子仁污染黃曲霉毒素的影響及脫除方法探討△

陳建茹，董偉偉，彭娟，焦曉林，吳馨琰，高微微*

(1.上海同濟堂藥業有限公司，上海 201707；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

柏子仁為柏科Cupressaceae植物側柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟種仁，具有養心安神，潤腸通便，止汗的功效[1]。柏子仁含豐富的油脂，在儲藏過程中受環境條件的影響，極易出現泛油、霉變等現象，嚴重影響柏子仁的品質[2]。為了保障用藥安全，《中華人民共和國藥典》2015年版新增了對柏子仁藥材及飲片黃曲霉毒素檢查項目，規定限量標準為黃曲霉毒素B1(AFB1) ≤5 μg·kg-1，黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1總量(AFs)≤ 10 μg·kg-1。我們查閱到有關柏子仁黃曲霉毒素污染調查的8篇報道中，總共23個批次，均有黃曲霉毒素檢出，其中20個批次超過《中華人民共和國藥典》2015年版限量標準，不合格率高達87%[3-10]，表明柏子仁黃曲霉毒素的污染問題比較嚴重。

黃曲霉毒素主要由黃曲霉Aspergillusflavus和寄生曲霉A.parasiticus產生，其生物合成受到溫度、濕度等多種因子的影響[11-12]。目前對于中藥材包裝儲藏研究多關注于藥材性狀、有效成分的變化[13-15]，而儲藏條件對黃曲霉毒素產生和積累的影響報道較少。對于已經污染黃曲霉毒素的中藥材，如何通過有效的處理技術脫除毒素在中藥材領域極少有研究，雖然在食品、農作物及飼料上有相關報道[16-18]，但這些方法是否適用于中藥材尚待研究。本文以黃曲霉毒素污染嚴重的柏子仁作為研究對象，分析對比在不同儲藏條件下柏子仁中黃曲霉毒素的變化，并采用不同脫除方法處理污染樣品，旨在為探尋柏子仁安全儲藏及黃曲霉毒素脫除方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試藥材

于2017年4月至10月期間，對市場收集的10個批次柏子仁進行黃曲霉毒素污染情況的檢測。選擇有污染的樣品用于儲藏與脫毒試驗。

1.2 儲藏試驗設計

將8 kg柏子仁樣品用塑料袋或真空包裝，分別放置于10 ℃低溫及25 ℃常溫2個貯藏庫。儲藏庫濕度各為65%和60%，分別于儲藏前及儲藏后1個月、2個月取樣，檢測柏子仁中黃曲霉毒素的含量。取樣時每個處理各取兩份樣品，每份樣品測定1次。

1.3 黃曲霉毒素脫除試驗

分別采用溫水、75%乙醇處理柏子仁。取500 g柏子仁加入1000 mL 45 ℃溫水或75%乙醇，攪拌5 min，置于不銹鋼篩網上瀝干，80 ℃干燥3～4 h，晾涼，存放于潔凈的塑料袋中，待檢。

1.4 黃曲霉毒素提取及含量測定

樣品按四分法取45 g左右，粉碎，過24目篩。參照《中華人民共和國藥典》2015年版通則2351第一法免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學衍生化法測定黃曲霉毒素含量[19]。免疫親合柱購于北京中科匯仁科技有限公司，高效液相色譜儀采用Agilent 1260，色譜柱采用C18反相硅膠柱(Agilent TC-C18(2)，4.6 mm×250 mm×5 μm)。色譜條件以甲醇-乙腈-水(20∶18∶62)為流動相，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進樣量為20 μL。通過與已知濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對照品(購于中國食品藥品檢定研究院，濃度分別為2.04×10-3、0.86×10-3、2.12×10-3、0.76×10-3ng·mL-1)比較，計算柏子仁樣品中AFB1及AFs的含量。

2 結果與分析

2.1 不同批次柏子仁黃曲霉毒素污染量

10個批次柏子仁樣品中共有9批樣品檢出黃曲霉毒素。其中有5批次樣品超出《中華人民共和國藥典》2015年版限量標準(AFB1≤ 5 μg·kg-1，AFs ≤ 10 μg·kg-1)，不合格率為50%(表1)。污染量最高的1批樣品(批號17-06-08-04)AFB1高達247.5 μg·kg-1，AFs為270.0 μg·kg-1。

表1 10批次柏子仁黃曲霉毒素檢測結果 μg·kg-1

注：ND表示未檢出。

2.2 不同儲藏條件下柏子仁的黃曲霉毒素含量

選擇17-07-01-01批次進行儲藏試驗。儲藏前的AFB1為3.2 μg·kg-1，AFs為3.9 μg·kg-1，均未超過《中華人民共和國藥典》2015年版限量標準。在10 ℃、25 ℃的溫度下儲藏1個月、2個月后，兩種包裝的所有樣品黃曲霉毒素的含量均有所增加，表現出隨儲藏時間延長黃曲霉毒素積累的趨勢，25 ℃儲藏下的毒素增加量高于10 ℃(表2)。10 ℃貯藏條件下，儲藏1個月的柏子仁AFB1已經超出藥典限量標準，在此時真空包裝與塑料袋包裝沒有明顯差別，AFB1的增加量為1.4和1.3倍，AFs的增加量為1.5倍和1.4倍；儲藏2個月時真空包裝的污染量高于塑料袋包裝，AFB1的增加量為4.5和2.7倍，AFs的增加量為4.3倍和2.3倍。25 ℃貯藏條件下，儲藏1個月后AFB1和AFs都超出標準，真空包裝的污染量高于塑料袋包裝，AFB1的增加量為5.1和2.0倍，AFs的增加量為6.3倍和2.2倍。儲藏2個月時，真空包裝的污染量則低于塑料袋包裝AFB1的增加量為5.4和8.3倍，AFs的增加量為7.8倍和4.9倍。

表2 不同儲藏條件下柏子仁的AFB1和AFs檢出量 μg·kg-1

注：表中數據為同一處理2次重復取樣測定的平均值。

2.3 不同處理對柏子仁黃曲霉毒素的脫除效果

75%乙醇洗和水洗對柏子仁中黃曲霉毒素具有一定脫除作用，脫除的效率存在差異。75%乙醇洗可使柏子仁樣品中AFB1由初始濃度52.6 μg·kg-1降低至5 μg·kg-1，脫除率為90.5%；AFs由初始濃度60.5 μg·kg-1，降低至5.8 μg·kg-1，脫除率為90.4%，處理后樣品黃曲霉毒素的含量降低至藥典限量標準以下(表3)。水洗對柏子仁AFB1的脫除率為87.7%；對AFs的脫除率為87.8%，處理后樣品黃曲霉毒素的含量仍高于藥典限量標準。

表3 不同方法處理柏子仁的黃曲霉毒素檢出量及脫除率

3 討論

10批次柏子仁的調查結果表明，柏子仁藥材中普遍存在黃曲霉毒素污染。郝愛魚等[3]調查了120批中藥飲片的黃曲霉毒素污染狀況，發現在各類藥材中種子類的污染率最高，達到30%以上，認為種子類藥材被污染的程度嚴重，應作為黃曲霉毒素監測的重點對象。種子類藥材含淀粉、蛋白、糖、脂類成分較多，有報道亞油酸的過氧化物通過作用于G蛋白信號通路刺激黃曲霉菌株產生黃曲霉毒素[20-21]；《中華人民共和國藥典》2015年版規定了柏子仁中AFB1/AFs的限量標準，隨之相關的檢測數據開始積累，綜合文獻報道及市場調查，我們發現柏子仁在種子類藥材中是污染最為嚴重的種類之一，推測柏子仁的脂類成分組成可能與其污染黃曲霉毒素嚴重有關，有待進一步研究證實。

本文涉及的兩個儲藏溫度10 ℃、25 ℃，兩種密封包裝條件下，柏子仁黃曲霉毒素在儲藏1個月后檢出量均有所增加。文獻報道A.flavus在花生上最低生長和產毒的溫度為13±1 ℃[22]，A.parasiticus的最低產毒溫度為10 ℃[23]。本實驗儲藏柏子仁的低溫庫為10 ℃，在這個溫度下柏子仁中仍有毒素產生，提示我們柏子仁上污染菌的種類及其在藥材上的產毒特性值得進一步研究。我們發現在真空包裝中柏子仁仍會發生黃曲霉毒素積累，這種現象在與其他一些飲片廠的交流過程中也被證實確實存在，原因一方面是污染菌在真空包裝中仍然存活，產毒真菌在不生長的情況下仍然可以合成黃曲霉毒素，這一現象與劉光憲等[24]報道4種不同材料的包裝袋抽真空充CO2氣體貯藏花生后AFB1含量隨儲藏時間增加而積累的結果一致。另一方面的原因可能與柏子仁的化學成分有關，在無氧條件下柏子仁中含有的促進黃曲霉毒素合成的成分如亞油酸、亞麻酸等相對穩定[25-27]，而它們的氧化產物如13S-過氧羥基-9,11-十八碳二烯酸(13S-HPODE)、脂氧合物反而可通過抑制毒素合成基因簇上aflO、cypA、ordA、aflR、aflS等基因的表達從而抑制產毒[27-28]，因此無氧條件下真空包裝中柏子仁的黃曲霉毒素含量有可能高于非真空包裝。本研究結果與以往真空包裝有利于食品保藏的觀念有所不同，提示柏子仁的黃曲霉毒素污染可能有其特殊性，在今后的工作中有必要深入研究含氧量及藥材成分對黃曲霉毒素合成的影響及機制。

研究結果表明，75%乙醇洗、水洗等洗脫法對于柏子仁中黃曲霉毒素的去除具有一定效果，與文獻報道洗脫法可去除蓮子、玉米中黃曲霉毒素的結果相一致，羅小榮等[29]報道水洗法可將蓮子中黃曲霉毒素總量由75.16 μg·kg-1降低至31.05 μg·kg-1，脫毒率為59%；胡蘭[18]利用水洗法去除玉米中的黃曲霉毒素，平均去毒率在80%以上。本研究表明，75%乙醇比水對柏子仁中黃曲霉毒素具有更好的脫毒效果，原因可能由于黃曲霉毒素溶于乙醇而不溶于水，75%乙醇洗不僅可以通過溶劑沖洗產生的力脫除柏子仁表面的毒素，還可以溶解出一部分內部的毒素，而水洗只產生前者作用。盡管如此，本實驗中75%乙醇洗和水洗的脫毒率均達不到100%，說明柏子仁一旦污染黃曲霉毒素很難完全去除，尤其對于污染嚴重的樣品，即使脫除了大部分毒素，脫毒后的樣品可能仍高于藥典的限量要求。從安全、經濟的角度考慮，作者認為防毒應比脫毒更重要，如何避免產毒真菌的污染將是今后工作的重點。本研究初步探討了柏子仁中黃曲霉毒素的脫除方法，關于脫除方法對柏子仁藥理活性是否存在影響及更高效的脫除技術等還有待于進一步研究和探索。研究的結果可為其他種子類藥材的相關研究提供借鑒與參考，尤其是《中華人民共和國藥典》2015年版已制訂黃曲霉毒素限量標準的酸棗仁、桃仁、蓮子、肉豆蔻、決明子、薏苡仁等品種。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：247-248.

[2] 何嫩艷.幾種易泛油霉變的藥材簡易貯存[J].黑龍江中醫藥，1994，3：52.

[3] 郝愛魚，趙麗元，劉英慧，等.HPLC柱后光衍生熒光法測定中藥飲片中黃曲霉毒素殘留量[J].藥物分析雜志，2012，32(12)：2203-2207.

[4] 謝昕，李紅艷.免疫親和柱凈化-光化學柱后衍生-高效液相色譜法測定柏子仁中的黃曲霉毒素[J].理化檢驗-化學分冊，2016，52(5)：541-544.

[5] 胡一晨，萬麗，范成杰，等.免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學衍生化法檢測中藥及染菌中藥制劑中間體的黃曲霉毒素[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(10)：116-119.

[6] 楊晶，欒國華，楊潤陸.液相色譜-串聯質譜法測定柏子仁中黃曲霉毒素殘留量[J].中國藥業，2011，20(14)：35-37.

[7] 栗建明，李純.中國藥典黃曲霉毒素檢測過程有關問題分析[J].今日藥學，2016，26(6)：405-409.

[8] 鄭潤生.中藥材污染真菌毒素的液質聯用高通量檢測研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2014.

[9] Chen A J，Jiao X L，Hu Y J，et al.Mycotoxins in traditional medicinal seeds from China[J].Toxins，2015，7：3858-3875.

[10] Yang M H，Hen J M，Hang X H.Immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography with post-column derivatization for analysis of aflatoxins in traditional Chinese medicine[J].Omatographia，2005，62(9-10)：499-504.

[11] Villers P.Aflatoxins and safe storage[J].Front Microbiol，2014，5：1-6.

[12] Abrar M，Anjum F M，Butt M S，et al.Aflatoxins biosynthesis occurrence toxicity and remedies[J].Crit Rev Food Sci，2013，53(8)：862-874.

[13] 晉小軍，黃惠英，李國琴，等.不同包裝條件對黨參皂甙含量的影響[J].中國野生植物資源，2002，21(5)：57-59.

[14] 蔣桂華，賈敏如，馬逾英，等.川芎儲藏條件的研究[J].中藥材，2005，28(6)：464-466.

[15] 殷艷秀，韓英麗，韓燁.淺談枸杞子的采收加工和儲藏保管方法[J].黑龍江中醫藥，1998，2：49-50.

[16] 葉盛群，陳南南，諶剛.霉菌毒素吸附劑對牛奶中黃曲霉毒素M1含量的影響[J].飼料工業，2012，33(17)：17-18.

[17] 黃達明，林琳，林克龍.加熱對減少花生中黃曲霉毒素水平的作用[J].中國油脂，2006，31(7)：51-53.

[18] 胡蘭.飼料黃曲霉毒素的研究進展[J].飼料工業，2001，22(3)：20-22.

[19] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：224-225.

[20] Passi S，Nazzaro-Porro M，Fanelli C，et al.Role of lipoperoxidation in aflatoxin production[J].Appl Microbiol Biotechnol，1984，19(3)：186-190.

[21] Brodhagen M，Keller N P.Signaling pathways connecting mycotoxin production and sporulation[J].Mol Plant Pathol，2006，7(4)：285-301.

[22] Diener U L，Davis N D.Limiting temperature and relative humidity for growth and production of aflatoxin and free fatty acids byAspergillusflavusin sterile peanuts[J].J Am Oil Chem Soc，1967，44(4)：259-263.

[23] Northolt M D，Verhulsdonk C A H，Soentoro P S S，et al.Effect of water activity and temperature on aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].J Milk Food Technol，1976，39(3)：170-174.

[24] 劉光憲，祝水蘭，周巾英，等.CO2密閉貯藏對花生脂肪氧化及黃曲霉生長的影響[J].食品研究與開發，2017，38(6)：197-200.

[25] 徐新剛，付加雷，閆雪生.柏子仁和柏子仁霜中脂肪酸的GC-MS比較分析研究[J].齊魯藥事，2009，28(9)：523-524.

[26] Tiwari R P，Mittal V，Singh G，et al.Effect of fatty acids on aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].Folia Microbiol，1986，31(2)：120-123.

[27] Yan S J，Liang Y T，Zhang J D，et al.Autoxidated linolenic acid inhibits aflatoxin biosynthesis inAspergillusflavusvia oxylipin species[J].Fungal Genet Biol，2015，81：229-237.

[28] Burow G B，Nesbitt T C，Dunlap J，et al.Seed lipoxygenase products modulateAspergillusmycotoxin biosynthesis[J].Mol Plant Microbe In，1997，10(3)：380-387.

[29] 羅小榮，李人趙，付剛劍，等.蓮子中黃曲霉毒素去除方法研究[J].現代食品，2017，19：115-119.