不同臟腑虛損對慢性阻塞性肺疾病患者病情及線粒體功能的影響＊

張少華，徐 丹，閆雪嬌，金 晶，荊 晶，姜 敏，李 爭，高 振，李風森,5＊＊

（1.新疆醫科大學中醫學院 烏魯木齊 830000；2.新疆國家中醫臨床研究基地COPD研究室 烏魯木齊 830000；3.新疆醫科大學附屬第一醫院中醫科 烏魯木齊 830000；4.新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸病理生理實驗室 烏魯木齊 830000；5.新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸科 烏魯木齊 830000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種常見的、可以預防和治療的疾病，以持續呼吸道癥狀和氣流受限為特征，通常是由于明顯暴露于有害氣體與顆粒引起的氣道和/或肺泡異常所導致的[1]。線粒體普遍存在于真核細胞（成熟紅細胞除外），是細胞進行有氧呼吸的主要場所，細胞生命活動所需的能量大約95%來自線粒體，被喻為人體的“能量工廠”。研究[2，3]證實COPD患者存在線粒體功能障礙，有大量外文文獻[4]認為線粒體參與了氣道重塑促進了COPD的發生。現代醫學多認為，COPD是氣道或肺組織暴露于有害氣體環境而致病，近年來也逐漸認識到宿主因素在發病中的重要作用。中醫理論認為臟腑虛損在COPD的發病中發揮了重要作用，正虛積損為COPD的主要病機[5]。本文通過橫斷面調查的方法探討臟腑虛損對COPD病情的影響，發現隨著臟腑虛損程度越來越重COPD病情也越來越重，具有肺脾腎三臟虛損特征的COPD病情表現最重；通過流式細胞術檢測不同臟腑虛損COPD患者外周血有核細胞線粒體功能，發現具有脾虛特征的COPD患者存在線粒體功能障礙，推測補脾療法可能改善線粒體功能障礙。現將研究結果報告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象

2016年1月至2017年10月在新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸科門診就診的穩定期COPD患者共161名。

1.1.1 納入標準

①志愿受試者，依從性好；②年齡40-80歲；③符合西醫診斷標準的COPD穩定期患者；④符合中醫臟腑虛損標準。

1.1.2 排除標準

①COPD急性加重期患者；②合并支氣管哮喘、支氣管擴張、氣胸、間質性肺病、胸腔積液、肺癌、活動性肺結核等其他嚴重肺部疾病的患者；③合并有嚴重心腦血管、肝腎和造血系統等原發性疾病患者；④精神病患者；⑤妊娠或哺乳期婦女；⑥合并腫瘤患者；⑦先天或后天性免疫缺陷者；⑧近1個月內參加過其它臨床試驗的患者。

1.1.3 診斷標準

（1）COPD的診斷

參照“GLOBAL INITIATIVE FOR CHRONIC OBSTRUCTIVE LUNG DISEASE 2016版”[1]制定。根據臨床表現、危險因素接觸史、體征及實驗室檢查等資料綜合分析確定。考慮COPD的主要癥狀為慢性咳嗽、咳痰和（或）呼吸困難及危險因素接觸史；存在不完全可逆性氣流受限是診斷COPD的必備條件。肺功能測定指標是診斷COPD的金標準。用支氣管舒張劑后FEV1/FVC＜70%可確定為不完全可逆性氣流受限。凡具有吸煙史及(或)環境職業污染接觸史及（或）咳嗽、咳痰或呼吸困難者均應進行肺功能檢查。COPD早期輕度氣流受限時可有或無臨床癥狀。胸部X線檢查有助于確定肺過度充氣的程度。

（2）COPD穩定期的診斷（參照GOLD2016修訂版）

患者咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩定或癥狀輕微。一般來說，患者持續4-6周癥狀穩定，未出現急性加重，即為穩定期。

（3）臟腑虛損診斷標準

依據中華中醫藥學會制定的《中醫內科常見病診療指南-中醫病證部分（2008版）》肺脹（ZYYXH/T4-49-2008）[6]和《慢性阻塞性肺疾病中醫診療指南（2011版）》[7]制定：

肺氣虛：①咳嗽和喘息、氣短，動則加重；②神疲、乏力或自汗；③惡風，易感冒；④舌質淡、苔白，脈沉細或細弱。具備①和②、③、④中的2項即可診斷。

脾氣虛：①不欲食，納呆或食少；②胃脘脹滿或食后脹甚或便溏；③神疲乏力，少氣懶言，自汗，動則加重；④舌體胖大或有齒痕，舌苔薄白或膩，脈沉細活沉緩或細弱。具備①和②中的1項，加中③、④的1項。

腎氣（陽）虛：①腰膝酸軟，神疲乏力；②男子滑精早泄，女子月經淋漓不盡；③耳鳴，頭昏或面目虛浮；④小便頻數清長，夜尿多，或咳而遺尿；⑤舌質淡，舌苔白，脈沉細或細弱。具備①、②中的1項加③、④、⑤中的1項。

一般來說，同時具備肺氣虛和脾氣虛者為肺脾氣虛，同時具備肺氣虛和腎氣（陽）虛者為肺腎氣虛，同時具備肺氣虛、脾氣虛和腎氣（陽）虛者為肺脾腎虛。

1.2 患者信息采集

記錄患者人口學信息及病史資料，采用COPD評估測試量表（CAT）[8]、呼吸困難量表（mMRC）[9]對患者進行評分、進行六分鐘步行試驗（6MWT）[10]。

1.3 線粒體實驗

采集外周靜脈血約2 mL，紅細胞裂解液（武漢博士德公司，批號：12F29C18）處理抗凝全血，裂解液工作濃度為細胞濕體積的3-5倍，置冰上操作約5-10 min至紅細胞裂解完全，期間需搖動混懸均勻，700 g 4℃離心棄上清提取有核細胞。PBS洗滌細胞沉淀1-2次制作細胞懸液，JC-1（美國sigma公司，批號：MKBX5979V）、DCFH-DA（南京建成公司，批號：20170331）染色，JC-1存儲液濃度為1 mg·mL-1（JC-1 1 mg，溶于二甲基亞砜1 mL），DCFH-DA存儲液濃度為10 mmol·L-1。具體染色方法：1 μL JC-1存儲液加入500 μL細胞懸液中；DCFH-DA 工作濃度為 10 μmol·L-1，1 μL DCFH-DA存儲液加入PBS1 mL制作工作液，取約500 μL工作液加入適量細胞沉淀重懸，37℃孵育30 min上流式細胞儀（Guava easyCyte 8HT，Merck Millipore公司）檢測，細胞懸液濃度不超過500 cells/μL，guavaSoft 2.7分析流式數據。

1.4 質量控制

中醫辨證結論不能取得一致時雙人再次核對并由中級職稱以上中醫師把關。肺通氣功能檢查采用日本產Chest HI-101型，測試質量控制達到A、B級。（參閱中華醫學會肺功能指南2014版）[11]。

表1 不同臟腑虛損COPD患者性別比較（卡方檢驗）

表2 不同臟腑虛損COPD患者mMRC比較（秩和檢驗）

1.5 統計分析

采用SPASS21.0數據統計軟件，計數資料采用卡方檢驗、計量資料符合正態分布方差齊采用單因素方差分析；相關性分析采用Pearson，不符合條件用非參數檢驗。

2 實驗結果

2.1 患者一般資料

按照中醫臟腑虛損標準，161例患者辨證為肺氣虛者36例、肺脾氣虛31例、肺腎氣虛50例、肺脾腎虛44例。患者年齡分布：肺脾腎虛組＞肺腎氣虛組＞肺脾氣虛組＞肺氣虛組，組間差異無顯著性（P=0.101），但兩兩比較肺氣虛組與肺脾腎虛組差異有顯著性（P=0.014）；性別分布經卡方檢驗各組間差異不具有顯著性（P=0.198），男女比率約為2∶1；身高在肺脾氣虛組表現最低，另外3組差異不明顯，4組間差異不具顯著性（P=0.429）；體重在肺脾氣虛組、肺脾腎虛組明顯減少，但4組間差異經統計學檢驗不具顯著性（P=0.384）；病程在肺脾氣虛組最長，肺氣虛組最短，4組間差異不具顯著性（P=0.503）。不同臟腑虛損COPD患者基線數據組間差異可參閱統計表1、表2。

2.2 不同臟腑虛損COPD患者病情比較

COPD患者mMRC經秩和檢驗組間差異有統計學意義（P=0.001）。肺功能FVC%在肺脾氣虛組最低，在肺氣虛組最高，但4組間差異不具有顯著性（P=0.265）；FEV1%在各組間差異具有顯著性（P=0.025，兩兩比較P值見表2.2）；CAT在各組間差異具有顯著性（P=0.001，兩兩比較P值見表2.2），6MWD在4組間差異不具顯著性（P=0.057），但肺氣虛組與肺脾、肺脾腎虛組比較差異具有顯著性（P＜0.05）；FEV1%、FVC%、6MWT均值在肺脾腎虛組最低，CAT均值在肺脾腎虛組最高（表3）。

2.3 不同臟腑虛損COPD患者外周血有核細胞線粒體功能比較

104例患者完成了線粒體實驗，線粒體膜電位采用紅、綠熒光細胞百分比，細胞內活性氧（ROS）取平均熒光強度MFI進行統計計算。肺脾氣虛組線粒體膜電位與肺氣虛組、肺腎氣虛組比較差異有顯著性（P＜0.05）；肺脾氣虛組細胞內活性氧與肺氣虛組、肺腎氣虛組比較差異有顯著性（P＜0.01）；肺氣虛組與肺腎氣虛組線粒體膜電位、細胞內活性氧無明顯差異。膜電位在肺脾氣虛組明顯降低，活性氧在肺脾氣虛組明顯升高；線粒體膜電位與活性氧存在相關性（相關系數0.223，P=0.021）。Pearson相關性分析顯示膜電位與活性氧相關系數0.223，P=0.021（表4）。

2.4 基線數據及各觀察指標統計圖

從圖1可以看出，臟腑虛損對病情的影響由單一肺氣虛，發展為肺脾、肺腎兩虛，進而三臟俱虛，FVC%、FEV1%、6MWT越來越低，CAT越來越高。線粒體膜電位在肺脾氣虛組最低，細胞內活性氧在肺脾氣虛組最高。

3 總結與討論

現代醫學認為COPD主要危險因素是吸煙，空氣污染和生物燃料暴露也參與了該病的發生，除了環境暴露宿主因素也是COPD發生的另外一個重要因素[1]。中醫理論認為，邪之所奏，其氣必虛。正氣存內，邪不可干，病焉從來？人體自身抗病能力降低，不能抵御外邪才致疾病纏綿不愈[12]。本研究發現，隨著臟腑虛損程度越來越重，COPD的病情也越來越重。COPD臟腑虛損由單一肺氣虛，發展為肺脾、肺腎兩虛，進而三臟俱虛。本研究結果顯示，肺脾、肺腎兩臟虛損相比較，肺脾氣虛證在FVC%、6MWD、CAT評分比肺腎氣虛更重且病程在肺脾氣虛組最長，說明肺脾氣虛較之肺腎氣虛病勢更為纏綿。雖然，肺脾氣虛證COPD纏綿難愈，但是，肺脾腎三臟虛損病情更為焦灼。研究數據顯示，COPD的病情總體表現在肺脾腎三臟虛損患者是最重的。FEV1%在客觀上反應了COPD患者的氣道阻塞程度，CAT則在主觀上反應了患者的病情，顯示了逐級演變的過程。COPD病之標在肺，病之本在脾更在腎。腎為先天之本，脾為后天之本。腎藏元陰元陽，腎陽不足不能溫煦脾陽，脾陽不足則痰濁內生，阻塞肺竅。腎陰不足，虛火上炎灼傷肺絡。內經云：女子五七陽明脈衰，面始焦，發始墜；男子五八腎氣衰，發墜齒稿。COPD發病多在40歲以后，這與內經描述的人腎氣衰退的時間節點是吻合的。本研究發現，具有腎虛特征的COPD患者占比58.38%，也說明了腎虛在COPD發病中的重要作用。

表3 不同臟腑虛損COPD患者FEV1%、FVC%、CAT、6MWD比較(xˉ±s)

圖1 各證型線粒體膜電位和細胞內活性氧平均熒光強度

線粒體呼吸鏈在利用氧產生ATP的同時也產生了大量的活性氧（ROS），導致線粒體DNA的損傷，Carpagnano等[13]發現MtDNA/nDNA的比率在COPD患者中顯著高于正常對照組。線粒體DNA損傷后可引起呼吸鏈有關蛋白質亞單位合成障礙，形成有缺陷的呼吸鏈。線粒體跨膜電位則是一種反映細胞受損效應較靈敏的指標，受到損傷后膜電位就會降低［14］。本研究發現，在肺脾氣虛組患者外周血有核細胞活性氧明顯升高、膜電位明顯降低，也證實了部分COPD患者存在明顯線粒體功能障礙。通常線粒體跨膜電位和ATP水平的升高表明線粒體功能增強，能量供應充足，動能增加，細胞、組織運動能力加強［15］。鑒于線粒體與運動的相關性，劉友章［16］從骨骼肌活動基本形式探討了“脾主肌肉”的病理生理機制，認為中醫脾的功能與線粒體的功能非常近似，從某種程度上說線粒體就是“脾”的重要組成部分，脾主肌肉亦是通過線粒體的功能來實現的。本研究數據顯示，FVC%、6MWD在肺脾氣虛組明顯下降，可能與呼吸肌、骨骼肌線粒體功能障礙，ATP供給不足有關。綜合本研究各組數據來分析，可以看出肺脾氣虛組患者是最有特點的一類，似乎脾虛對COPD病情的貢獻度最大。本研究發現具有脾虛特征的COPD患者存在線粒體功能障礙，推測補脾療法可能改善線粒體功能障礙，為COPD患者線粒體功能障礙的治療提供了方向。

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2 Lacedonia D,Carpagnano G E,Crisetti E,et al.Mitochondrial DNA alteration in obstructive sleep apnea.Respir Res,2015,16(1):47.

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