響應面法優化“金花”菌培養基配方

周國慶，譚玉梅，王亞萍，黃永會，任錫毅，劉永翔，劉作易

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025 ；2.貴州省農業科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550009；3.貴州省農業生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006；4.貴州省農業科學院，貴州 貴陽 550006)

茯磚茶是我國特有黑茶，屬于后發酵茶[1]。茯磚茶具有多元化的保健功能，其中的茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱，即黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類及酚酸類中多元酶類及其衍生物的混合物。茶多酚還是一種新型天然抗氧化劑，具有清除自由基、抗衰老等作用[2]；另外對預防心血管疾病效果尤為顯著，具有降血壓、血脂、血糖等方面的作用[3]。

茯磚茶制造主要步驟包括毛茶制作、毛茶堆放、半成品拼配、氣蒸、渥堆、壓制成型、發花干燥和切割包裝等[4]。其中“發花”是茯磚茶生產制造過程中最獨特工藝，發花過程就是“金花”菌產生的過程[5]；“金花”越多，茶葉質量被認為越好，其被作為黑茶品質優劣的重要指標[6-7]。冠突曲霉是發花過程中的優勢菌種，也正是它在茶葉發酵過程中產生一系列的代謝產物賦予了茯磚茶各種保健功效。

傳統的茯磚茶制作采取的是自然發花，存在發花周期長及產品不穩定的問題，目前大多數茶葉生產企業也都存在發花差，發花參差不齊甚至不發花等問題[8]。研究者們通過研究發現人工接種發酵從發酵周期、功效成分產量、感官評定等各方面都明顯優于自然發酵[9]。所以人工接種必定可以改善茯磚茶的品質，然而人工接種所用的培養基制備及優化是解決人工接種的關鍵性問題。歐陽梅和羅冰[9-10]等人用單因素試驗及單水平正交的方法制備的“金花菌”液體培養基都相對比較復雜，不便于制備。本文將優化以麥麩為基礎的單菌發酵劑，以發酵劑中產孢量為研究對象，在單因素的實驗基礎上，應用響應面法對發酵劑的配方進一步優化，以期獲得能在較短時間內培養出高孢子濃度的培養基。而這種用料簡單，配置方便，經濟節約的培養基一定能加速人工接種的推廣，同時還為進一步的培養基優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

冠突曲霉：由貴州省農業科學院微生物重點實驗室分離于茯磚茶上的“金花菌”，經本實驗室鑒定為冠突曲霉( Aspergillus cristatus)。菌株號為GZAAS20.1004。

高滲MYA培養基[11]：麥芽提取物20 g，酵母提取物5 g，蔗糖30 g，NaCl 140 g，瓊脂粉12 g，加蒸餾水定容至1000 mL。液體培養基不加瓊脂粉，分裝，及時滅菌，滅菌條件115℃，15 min。

1.2 儀器

各種規格的移液槍(Eppendorf)、SS-325型高壓滅菌鍋(日本TomyKogyo公司)、超純水系統(Purelab公司)、常溫冰箱(海爾集團)、-20℃低溫冰箱(海爾集團)、BSS300-WEI電子天平(德國賽多利斯)、電熱恒溫培養箱、超凈工作臺、制冰機、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)、TS-2102C搖床等其它小型儀器均為國產儀器。

1.3 方法

1.3.1冠突曲霉的培養及孢子懸浮液制備 將冠突曲霉接種于高滲MYA培養基上，37℃培養7 d，在超凈工作臺上，用滅菌過的刀片刮取冠突曲霉，放入帶有適量玻璃珠的滅菌三角瓶內，每刮取10個平板上的冠突曲霉倒入100 ml無菌水，于搖床上震蕩30 min轉速設定為150 r/min，再用滅菌過的脫脂棉過濾三角瓶里的菌液，最后對所得濾液利用血球計數板在顯微鏡下計數；最后保存4℃冰箱備用。

1.3.2發酵液孢子濃度測定方法 無菌環境下向28℃培養了7 d的三角瓶內加100 ml無菌水，震蕩搖勻后靜置40 min，再利用兩層紗布過濾，將濾液倒入滅菌過的放有玻璃珠的三角瓶后放入搖床150 r/min，震蕩1 h，將震蕩后的溶液利用血球計數板計數。取一塊潔凈干燥的血球計數板，蓋上干凈的蓋玻片，吸取菌懸液從血球計數板兩槽處滴加菌液，待菌懸液浸滿計數室，靜置5 min后鏡檢計數[8]。

金花菌孢子數(ml)=N/5×25×104×稀釋倍數

采用25×16規格的計數板，N代表5個中方格孢子總數

1.4 實驗設計

1.4.1單因素試驗 準備500 ml三角瓶若干，利用60目篩子篩去麩皮淀粉末，在各三角瓶內稱取10 g麩皮并按照表1添加含水量、NaCl與接種量。表1為單因素試驗設計，除考察因素外，其余條件均一致并在28℃條件下培養7 d時，將發酵物浸泡過濾處理后測定孢子含量，初步確定各單因素最佳水平。

1.4.2Box-Behnken設計 結合單因素結果的分析，使用Design Expert中的BBD設計以上3個因素三個水平(共17個試驗點，5個中心點)的響應面試驗，以發酵劑孢子濃度為響應值[12]。

1.5 統計分析

利用Design Expert軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，得到二次多項式，對該方程進行顯著性、方差分析并分析響應面試驗結果，確定發酵劑最大孢子含量下對應的含水量，氯化鈉濃度及接種量[13]。最后用經響應面優化后的發酵條件進行三次驗證實驗來驗證模型預測的準確性。

表1 單因素試驗因素水平表Tab.1 Factors and the levels of experiment of single factor experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1含水量對產孢量的影響 由圖1可以看出，不同的含水量對產孢量影響比較大，隨著含水量的增加，產孢量呈遞增趨勢，當含水量為10 ml時，產孢量最大，達到1.8×107個/ml，高出5 ml含水量的孢子數2倍多，表明適宜的含水量對培養基起著極其重要的作用。對于含水量超過10 ml時，產孢量突然下降，其原因可能是由于含水量過高致使冠突曲霉的呼吸代謝受阻，抑制了其菌體的生長和產孢能力。

圖1 含水量對產孢量的影響Fig.1 Effect of moisture content on sporulation

2.1.2NaCl對發酵劑產孢量的影響 由圖2可知，NaCl的添加量對產孢量影響也較大，當NaCl含量達5%的時，產孢量達到最大即2.01×107個/ml。當NaCl添加量高于5%時，產孢量急劇下降，表明NaCl添加量過大對冠突曲霉的產孢量有抑制作用。究其原因可能是NaCl所離解出的Na+和Cl-細胞內外滲透壓與電位差有著重要影響，進而使其細胞營養物質運輸受影響，產生單鹽毒害，致使微生物活性受影響，最后造成產孢量不斷減少。此結果和羅冰等人研究結果基本一致[10]。

圖2 NaCl濃度對產孢量的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on sporultion

2.1.3接種量對發酵劑產孢量的影響 從圖3可以看出，隨著接種量的增加，產孢量先呈上升趨勢后下降，當接種量為240 μl的時候孢子產量最高達到1.98×107個/ml。其原因可能是由于接種量較低時，孢子基數較少，因此其產孢量低，當接種量增加時，孢子基數較多，使菌體生長提前進入對數期，致使菌體營養代謝加快，從而提高了產孢量；當接種量過大時，孢子基數較多，培養基中的營養物質不能滿足微生物的需要，抑制了菌體的生長，因此產孢量呈下降趨勢。

圖3 接種量對產孢量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on sporulation

2.2 冠突曲霉單菌發酵劑響應面法優化

2.2.1響應面因素水平的選取 根據Box-Behnken的驗設計原理，綜合2.1單因素影響試驗結果，分別選取含水量(ml)、NaCl(%)以及接種量(μl)三個因素的高中低三個水平，在單因素的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法[12]，試驗因素水平見表2。

表2 響應面試驗因素及水平Tab.2 Factors and the levels of experiment of Response Surface Analysis

2.2.2響應面分析試驗設計及結果 以含水量A、氯化鈉濃度 B以及接種量C為自變量，以發酵劑孢子濃度為響應值(Y)，進行響應面分析試驗，試驗方案及結果見表3。

2.2.3多元二次響應面回歸模型的建立及分析 利用Design Expert軟件對表3實驗數據進行多元回歸擬合，得到響應曲面二次多元回歸方程：

Y=34.84-1.09A+1.03B+2.73C-0.21AB-0.29AC-0.62BC-13.40A2-18.02B2-8.34C2

各因素的方差分析見表4。

表3 Box-Behnken實驗設計方案及結果Tab.3 Box-Behnken design and results

分析表4可知，該模型p<0.0001，失擬項p=0.9721>0.05可知該模型回歸極顯著，失擬項不顯著，不需要引入更高次項系數。模型的復項關系數R2=0.9999，說明該模型的擬合較好，各個因素對響應值的影響不是線性關系，能較好的模擬不同條件下產孢量的預測。校正復項關系數AdjR2=0.9999，信噪比Adeq Precision270.872>4，說明該模型在設計區間內誤差小，預測較為準確。

從表4可以看出，影響產孢量的A、B、C三個因素影響水平均達到極顯著水平P<0.0001。各因素間的交互作用AB、AC、BC均達到顯著水平P<0.05，等高線均接近圓形[14]。其中BC交互作用達到極顯著水平P<0.0001見圖6，AB及AC的等高線圖及響應面圖見圖4、圖5。

表4 回歸模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance with regression model

注：Pr值是方差齊性檢查的結果；“**”表示極顯著水平，“*”表示顯著水平。

圖4 含水量與NaCl對產孢量影響的等高線圖和響應面圖Fig.4 Response Surface of interrelated influence of NaCl content and sporulation

圖5 含水量與接種量對產孢量影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Response Surface of interrelated influence of moisture content and sporulation

圖6 NaCl與接種量對產孢量影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Response Surface of interrelated influence of inoculation amount and sporulation

2.2.4模型驗證 在獲得非線性回歸模型后，為求得最大產孢量，利用Design expert 8對所得回歸擬合方程各自變量求一階偏導數，求得次方程得到最大產孢量最優條件為A=-0.042、B=0.026、C=0.162換算成實際值為含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接種量246.48 μl，預測的最大產孢量為3.51×107個/ml。

為了驗證該模型的準確性和實用性，用經響應面優化后的發酵條件進行三次驗證實驗，產孢量分別為3.43×107個/ml、3.48×107個/ml、3.37×107個/ml，與預測結果3.51×107個/ml基本一致，表明該模型準確性和實用性高，能較好的預測產孢量。

3 結論與討論

在單菌發酵劑的制備中，影響發酵劑產孢量的因素很多，這些因素之間并不是孤立的，而是互相有聯系的[15]。利用Design expert 8 軟件，該軟件是一款面向實驗設計以及相關分析的軟件，可以根據具體要求設計出高效的實驗方案，并對實驗數據做專業的分析，給出全面的可視的模型以及優化結果[16]。傳統的正交設計可以同時考慮幾種因素，尋找最佳因素水平組合，但是不能在給出的整個區域內找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式即回歸方程，故只能分析離散型數據，且存在試驗次數多，精度不夠高及預測性不佳等缺點[17-18]。響應面法(RSM)最早是由數學家Box和Wilson于1951年提出來的。利用合理的試驗設計方法并通過試驗得到數據，采用二次回歸方程來擬合因子和響應值之間的函數關系，指導多變量優化問題[19]，其中基于Box-Behnken設計的響應曲面法可以進行因素數在3～7個內的試驗；試驗次數為15～62次，在因素數相同時比正交試驗所需的次數少，對于本試驗是一種比較理想的方法。該方法通過響應面圖直觀的分析了三個因素對于產孢量的影響，同時還可以觀察各因素之間的交互作用的影響[20]。

傳統的發花工藝是指茶葉在一定的水熱條件下，其周圍的優勢菌種如冠突曲霉大量繁殖，形成胞外酶，這些酶和茶葉中的多酚化合物等成分聚合、分解，與微生物本身一起形成了特殊的色、香、味、形[9]。這種自然發酵的過程固然很美妙，但因為周期長、烘房周轉困難、條件難以控制、容易污染、發花不均一等問題導致產品品質難以保證，質量難以提升，大幅限制了很多茶葉公司的發展。

但是這些難題都可以在人工接種發花中找尋到解決的辦法。科學家們研究發現人工接種發酵能大幅度縮短發酵的時間，縮短了發花的周期，而且人工接種使用的單菌發酵劑可以保證優勢菌的生長，控制并減少雜菌的污染以提高茶葉的飲用安全性。本試驗應用響應面設計法優化最佳的培養基成分添加量：含水量9.79 ml、NaCl 6.13%、接種量246.48 μl，得到的最大產孢量約為3.51×107 個/ml。實驗結果說明通過響應面分析這種方法來優化冠突曲霉發酵劑的成分，能夠使發酵劑孢子含量得到大幅度提高。這種用麩皮為基礎制得的單菌發酵劑相較于羅冰和歐陽梅等由察氏培養基優化得到的液體發酵劑，成本更低廉，操作更簡便，且本發酵劑產孢量高，易于連續培養，對于人工接種發酵的發酵劑制備及優化研究提供一定的參考。

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