同位素內標液質聯用法測定動物源食品中的氯丙嗪殘留量

吳基任 李成 譚高好 莫秋岸 徐彬

摘 要 建立測定動物源食品中氯丙嗪（Chlorpromazine）殘留量的液相色譜串聯質譜同位素內標方法。樣品用乙腈和水（80/20）超聲波提取后，用Waters Oasis PRiME HLB小柱凈化，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離。以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，用電噴霧正離子（ESI+）多反應監測、基質校準同位素內標法進行定量分析。方法在0.1～20 μg/L范圍內具有良好線性，相關系數r=0.998。樣品在低、中、高3個濃度水平下的平均回收率為89.1%～93.5%，相對標準偏差（RSD）為2.5%～4.8%。檢出限（S/N=3）為0.1 μg/kg，定量下限（S/N=10）為0.3 μg/kg。

關鍵詞 超高效液相-串聯質譜 ；同位素內標 ；氯丙嗪 ；動物源食品

中圖分類號 O656.31 文獻識別碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.021

Abstract Chlorpromazine residues in animal-based food were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and quantified by using an isotope-labeled internal standard. The samples were extracted by acetonitrile and water （80/20）， purified by Waters Oasis PRiME HLB column， separated by Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column. The acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution were used as the mobile phase for gradient elution. The chlorpromazine was detected by using electrospray ionization （ESI+） in positive ion mode with multiple reaction monitoring （MRM）， and its quantity was analyzed by using the matrix matched calibration method combined with the stable isotope-labeled internal standard. This combined method had a good linearity in the range of 0.1～20 g/L， and its correlation coefficient was r=0.998. The mean recoveries of spiked samples at three levels （low， moderate and high） ranged from 89.1% to 93.5% with relative standard deviations （RSD） of 2.5%～4.8%. The detection limit （S/N=3） was 0.1 g/kg， and the lower limit of quantitation （S/N=10） was 0.3 g/kg.

Keywords supper-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ； isotope-labeled internal standard ； chlorpromazine ； animal-based food

氯丙嗪（Chlorpromazine）是一種吩噻嗪類藥物，在臨床上作為中樞多巴胺受體的阻斷劑，作用于中樞神經系統，常用來鎮吐、鎮靜催眠以及抗暈眩、暈動癥等[1-2]。因經濟利益的驅使，一些養殖戶在飼料中違規添加氯丙嗪來抑制家畜的運動，以達到育肥的目的；或是在家畜的長途運輸過程中使用氯丙嗪，以減輕動物的應激性，降低死亡率[3-5]。氯丙嗪在家畜飼養中的濫用，會通過動物性食品的殘留直接危害到人類健康[6-9]。衛生部于2010年3月22日公布的第四批“食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單”中就包含了氯丙嗪。而且我國農業部235公告明確規定了氯丙嗪等精神類藥物只允許治療使用，且不得在動物性食品中檢出[10]。目前現行有效的氯丙嗪殘留檢測方法為GB/T 20763-2006，適用基質是豬腎和肌肉組織[11]，根本無法滿足現在的要求，且該方法前處理過于復雜，實際應用中氯丙嗪加標回收率偏低[12]。因此建立簡單準確的動物性食品中氯丙嗪的檢測方法，給食品風險預警和食品安全監管提供技術支撐勢在必行[13-14]。本研究分析了前處理方法和色譜條件等對動物性食品中氯丙嗪殘留量同位素內標液質聯用法檢測效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和設備

LC-30超高效液相（日本島津），QTRAP 5500三重四級桿液質（美國AB SCIEX），SK7200B超聲波清洗器（上海科導），T-18均質機（IKA廣州），Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph），Centrifuge 5804高速離心機（德國Eppendorf），DG-12型固相萃取裝置（美國Supelco）；Autovap S60氮吹儀（美國ATR），XS-205電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo），Milli-Q超純水制備系統（美國MILLI-PORE）。

1.1.2 試劑和樣品

鹽酸氯丙嗪標準品（德國Dr.Ehrenstorfer），鹽酸氯丙嗪-D6同位素內標（德國Dr.Ehrenstorfer），乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國默克公司），Waters Oasis PRiME HLB小柱：200 mg/6 mL（美國Waters），實驗用水為超純水，樣品為農貿市場不同攤位采購的豬肉、牛肉、羊肉各10批。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將樣品切成小塊后用勻漿機粉碎，稱取5 g樣品于50 mL離心管中，添加氯丙嗪-D6內標溶液，漩渦混勻；加入10 mL 80%乙腈水溶液，漩渦混勻2 min，置于超聲波清洗器超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液直接加載到Waters Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，保持1滴/s的流速，收集全部流出液；在40℃下氮氣吹至近干，用10%甲醇水溶解定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜，上LC-MS/MS測定[15]。

1.2.2 標準溶液的配制

準確稱取鹽酸氯丙嗪標準品、鹽酸氯丙嗪-D6同位素內標，用甲醇配制成10 μg/mL標準儲備液，用甲醇將標準儲備液稀釋成100 μg/mL標準工作液。

1.2.3 儀器分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18 1.7 μm，2.1×100 mm。

流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：2 μL。梯度洗脫程序見表1。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力（GS1）：50 psi；氣簾氣壓力（CUR）：20 psi；輔助氣壓力（GS2）：50 psi。質譜參數條件見表2。

2 結果與分析

2.1 樣品處理的優化

畜肉基質復雜，含有大量的蛋白質、脂肪及非極性磷脂類干擾物，極大地干擾目標化合物的分析，這就要求前處理必須能夠凈化畜肉的復雜基質，同時釋放出目標化合物。試驗使用不同濃度的乙腈溶液處理樣品，提取目標化合物，同時起到沉淀蛋白的目的。試驗比較了70%、80%、90%乙腈水溶液及純乙腈溶液提取效率和凈化效果，發現含80%乙腈水溶液提取效率最高。在固相萃取小柱的選擇上，選取了Waters Oasis HLB （200 mg/6 mL）和Waters Oasis PRiME HLB（200 mg/6 mL）進行比較，這2種固相萃取小柱均無需活化、淋洗及洗脫。而Waters Oasis PRiME HLB作為增強型除磷脂等非極性干擾物的新型反相SPE吸附劑，結合80%乙腈水溶液作為提取液沉淀蛋白，能夠有效地除去畜肉樣品中的大部分基質干擾，獲得更干凈的樣品譜圖及準確分析結果，2種固相萃取小柱對豬肉、牛肉、羊肉3種陰性基質的凈化效果見下圖1和圖2。

2.2 色譜流動相的條件的優化

采用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，將空白基質配制的1 ng/mL標準溶液進樣測試，比較出峰情況，發現流動相水相加入5 mmol/L乙酸銨，可以改善色譜峰拖尾的問題，但存在響應值偏低的問題，而乙腈-0.1%甲酸水溶液則有利于化合物的離子化，信號響應得到增強。綜合考慮基質干擾、靈敏度、峰型等因素，選取乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。氯丙嗪及D-6氯丙嗪總離子流圖及二級質譜圖見圖3和圖4。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

精確吸取氯丙嗪標準溶液、D6-氯丙嗪內標溶液，用處理好的陰性樣品溶液稀釋，配置成2 ng/mL的D6-氯丙嗪內標，氯丙嗪為0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL的標準系列。按優化好的儀器條件對標準系列進行測定，以目標化合物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標繪制工作曲線，得到線性回歸方程：Y= 18.116 72X-0.205 02，相關系數r =0.998，表明目標化合物在相應的濃度范圍內線性關系良好。在陰性樣品中添加一定量的氯丙嗪及D6-氯丙嗪，按1.2.1處理后上機測定，根據定量離子對色譜峰的信噪比[其中信噪比（S/N=3）為檢出限，信噪比（S/N=10）為定量下限]，得出該方法檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

2.4 方法的準確度和精密度

取陰性豬、牛、羊肉，分別添加0.5、2、10 μg/kg 3個水平的加標試驗，每個水平進行6個平行試驗，以考察方法的準確度，結果見表3。從表中可知，氯丙嗪在豬、牛、羊這3種基質中的3個水平加標，回收率在89.1%～93.5%，相對標準偏差RSD（n=6）在2.5%～4.8%，符合GB/T 27404-2008 《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》標準附錄F中F.1回收率的要求（被測組分含量<0.1 mg/kg時，回收率范圍為60%～120%）及標準附錄F中實驗室內變異系數的要求[相對標準偏差RSD（n=6）<10%]。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對市場采購的10批共30份豬肉、牛肉、羊肉樣品進行檢測，其中僅有1份豬肉檢出略低于檢出限（0.07 μg/kg）的氯丙嗪，牛肉、羊肉中未檢出，結果見表4和圖5。

3 討論

本實驗采用80%乙腈-水溶液超聲渦旋提取，建立了同位素內標液質聯用法測定畜肉中氯丙嗪的方法。針對豬肉、牛肉、羊肉等3種基質的陰性樣品，通過加標回收、精密度和市場采購試樣的測試結果可知，該方法前處理操作簡便、快速，凈化效果好，精密度和準確度高，檢測靈敏度優于現行有效的國標方法，很適用于大批量畜肉樣品中氯丙嗪的監測。

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