高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測鮮凍肉中違禁注水藥物

李志剛，任 南，馬燕紅*，李瑩瑩，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

注水肉[1]是少數(shù)不法商販在利益的驅動下，在宰前或宰后對牲畜人為地采用注射器、壓力泵等工具，對豬、牛、羊等注入一定量的水分，以此增加酮體的質量[2-3]。不潔凈的水進入肌體會引起體細胞膨脹性的破裂，導致蛋白質流失，降低的肉的品質；注水后易造成病原微生物的污染，不僅使肉的營養(yǎng)成分受到破壞，而且還將產(chǎn)生大量的細菌毒素，甚至引入非肉源性污染物[4]，食用后會對食用者的身體造成傷害[5-8]。

目前僅依據(jù)水分含量是否超過GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》判定是否為注水肉。但畜禽肉類水分含量是一個很復雜的問題，水分含量受飼養(yǎng)方式、肉的部位、宰殺方式、銷售形式等因素影響[9]。前人采用感官判別法、試紙法[10-11]、近紅外法[12-13]、低場核磁共振法[14-15]、傳感器法[16]等鑒別注水肉。但目前仍無可行的注水肉判別方法。

畜肉注水通常是活體注入，利用機械泵等強行向動物體內灌水，此時由于外部的刺激，動物體就會由于疼痛而產(chǎn)生應激反應，在這種條件下宰殺的畜肉會出現(xiàn)如白肌肉等品質較差的肉，大大影響肉的銷售質量。為了提高肉的質量，確保肉的感官狀態(tài)良好，同時躲避監(jiān)管及處罰，不法商販對注水方式進行改良，在注水的同時，為豬、牛、羊等注射一些保水藥物和消炎藥物，便于肌肉蓄積大量水分，并緩解其疼痛感。目前報道的用于豬肉保水劑的藥物有阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、利多卡因、普魯卡因和沙丁胺醇等[17-18]。殘留的藥物毒性較大，會引起如反應遲頓、精神衰頹、昏迷、口干、瞳孔放大等癥狀[19-21]。該種作案手法不但隱蔽，而且大大改善了畜肉保水的效果，也降低了被查處的風險，同時也增加了監(jiān)管的難度。

畜肉中保水劑藥物的檢測方法較少，也未有任何相關的檢測標準。國內外關于這類藥物的檢測也多見于醫(yī)學領域[22-25]。所用的方法有氣相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法等[17,26-28]。為了嚴厲打擊非法作案手段，加強畜肉屠宰、銷售的監(jiān)管，建立一種畜肉中阿托品、利多卡因、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、沙丁胺醇等藥物準確、便捷的檢測方法是非常必要且迫切的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿托品、利多卡因、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、沙丁胺醇標準品（純度≥98%），甲醇、乙腈（均為色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；水為一級水。

1.2 儀器與設備

1260超高效液相色譜-6470串聯(lián)四極桿質譜儀 美國Agilent公司；S-100渦旋儀、SR-IIw振蕩器 日本Taiyo公司；離心機 日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱 沃特世科技（上海）有限公司；固相萃取柱活化流程：甲醇+三級水活化；三級水淋洗，甲醇接收。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準溶液：分別準確稱取各標準品10.0 mg，用甲醇配制成100 mg/L的標準儲備液，4 ℃冷藏保存。

混合標準溶液：分別吸取各標準溶液適量，用甲醇配制成混合標準溶液。

標準工作溶液：用時將上述混合標準溶液用水逐級稀釋為標準工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3.2 提取

稱取試料5 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，加蓋后渦旋2 min，再用振蕩器振蕩10 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液倒入25 mL容量瓶中。于殘渣中再加入10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，同法操作，合并兩次上清液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液定容至刻線。

1.3.3 凈化

取上清液5 mL至HLB小柱，以小于3 mL/min通過Oasis HLB小柱后，用5 mL水淋洗，棄去全部流出液，在65 kPa的負壓下，減壓抽干1 min，最后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，加入1.00 mL甲酸-水（1∶99，V/V）溶液，渦旋0.5 min，過0.45 μm濾膜，供測定。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相A：甲酸-水（1∶99，V/V）溶液；流動相B：乙腈；流速：0.40 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

表2 6 種藥物的多反應監(jiān)測質譜參數(shù)Table2 Mass spectrometric parameters in MRM mode for 6 drugs

質譜條件：電噴霧（electrospray ionization，ESI）離子源：正離子模式；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣流速：8 L/min；噴針氣壓力：35 psi；噴嘴電壓：500 V；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；多反應監(jiān)測參數(shù)見表2。

2 結果與分析

2.1 液相色譜及質譜條件的優(yōu)化

6 種目標化合物的結構式如圖1所示。6 個化合物均為弱極性化合物，在C18柱上有較好的保留。利多卡因、普魯卡因和沙丁胺醇均含氨基，容易得到帶正電荷的基團，在正模式下靈敏度較高，因此選取正ESI模式檢測；在ESI+模式下，通過直接進樣法，優(yōu)化各化合物的質譜條件，確定各物質的母離子的質量數(shù)。實驗結果發(fā)現(xiàn)：在ESI+模式下，化合物得到[M+H]+準分子離子峰，以此作為它們的母離子。在此基礎上，選擇兩個豐度較高的子離子，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終選定定量分析的條件，結果見表2，6 種化合物定量離子流圖見圖2。

圖1 目標化合物的結構式Fig.1 Structures of the target compounds

圖2 6 種化合物定量離子流圖Fig.2 MRM chromatograms of quantitative ion pairs for 6 compounds

2.2 提取條件優(yōu)化

圖3 提取劑對回收率的影響（n=3）Fig.3 Effect of extraction solvents on the recoveries (n = 3)

阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿等含有活潑的羥基和酯基，普魯卡因、利多卡因和沙丁胺醇為氨基化合物，均極易溶于甲醇和水。對比了甲醇、水、磷酸鹽作提取溶劑，加標量為25 μg/kg時的回收率。圖3表明，用磷酸鹽緩沖液作提取溶劑時，平均回收率達到85%，故本實驗選取磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇與優(yōu)化

由于動物源性食品基質復雜，選用固相萃取柱可以得到較好的凈化效果。實驗對比了HLB、C18柱、MCX柱對目標化合物的選擇性。圖4表明，HLB柱子對于磷脂和蛋白有較好的去除效果，對目標化合物（添加量為25 μg/kg）回收率均高于C18柱和MCX柱。

圖4 SPE柱對回收率的影響（n=3）Fig.4 Effect of SPE columns on the recoveries (n = 3)

2.4 方法學結果

2.4.1 基質效應

基質效應是由基質中的共提取干擾物與目標化合物競爭電離所致[29]，鮮凍肉等肉類由于其脂肪、蛋白含量比較高，在樣品提取的過程中會由于這些復雜基質而對結果的檢出限及回收率造成影響。因此通過配制空白基質曲線以及溶液標準曲線，根據(jù)基質效應來評價鮮凍肉的基質效應大小[30]（基質效應/%=（基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1）×100）。

根據(jù)評價指標，所得的數(shù)值為負值時表示基質效應為抑制，當所得數(shù)值為正值時表示基質效應為增強狀態(tài)。由表3可見，沙丁胺醇、普魯卡因、山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品、利多卡因基質效應分別為12%、11.5%、9.8%、10.2%、10.9%、9.5%，6 種化合物的基質效應都在正的10%左右，因此考察回收率時，應考慮其基質效應。因此本實驗通過配制基質標準曲線來扣除基質帶來的影響。

2.4.2 線性與檢出限和定量限

對6 種化合物質量濃度為0.25～50 μg/L的空白基質曲線進行測定，得到一系列不同質量濃度的色譜圖，以響應值為縱坐標，化合物質量濃度為橫坐標繪制不同化合物的線性方程以及r值，得到6 種化合物的標準曲線方程。同時根據(jù)3 倍信噪比確定6 種化合物的檢出限；以10 倍信噪比確定6 種化合物的定量限，見表3。6 種藥物在0.25～50 ng/mL范圍內線性關系良好，線性相關系數(shù)均大于0.99，檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和2.0 μg/kg。

表3 6 種化合物的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限Table3 Regression equations, correlation coeff i cients, LODs and LOQs for 6 drugs

2.4.3 加標回收率和精密度實驗結果

稱取空白樣品6 份，每份5.0 g，分別添加2.0、25、50 μg/kg添加混合標準溶液后按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法制備后進行測定，結果見表4。從表4可知，6 種物質回收率在78.07%～96.76%之間，相對標準偏差在0.4%～2.1%之間，回收率和精密度均符合實驗要求。

表4 不同基質中加標回收率結果（n=6）Table4 Recoveries of 6 drug spiked to different matrix samples (n= 6)

2.5 實際樣品檢測結果

采用此方法對市場上購買的60 件畜肉樣品進行檢測，種類包括牛肉、羊肉、豬肉，結果在1 件牛肉樣品中檢出普魯卡因，含量為3.0 μg/kg，其余樣品均未檢出，同時對該陽性樣品按照GB 5009.3—2016進行了水分測定，結果表明該樣品水分超標。

3 結 論

本實驗用液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、利托卡因、普魯卡因和沙丁胺醇6 種注水肉中的保水劑，方法簡便、快速，最低檢出限為0.5 μg/kg。系統(tǒng)的方法學評價結果表明，本方法準確、可靠，適用于畜肉中阿托品、山莨菪堿、東莨菪堿、利托卡因、普魯卡因和沙丁胺醇的檢測。考慮農業(yè)部235號公告中阿托品及普魯卡因的使用要求，本檢測方法僅作為注水肉判別的輔助手段，同時可為后續(xù)注水肉完善的鑒別方法提供幫助。

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