腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦混養中的應用

薛德林 柳學成 程貴良 劉志國 王冠穎 戰曉燕 胡江春

1 中國科學院沈陽應用生態研究所 沈陽 110016

2 東營海躍生物飼料有限公司 東營 110000

3 遼寧威蘭生物技術有限責任公司 沈陽 110032

4 上海農林職業技術學院 上海 201600

腐植酸是一種廣泛存在于自然界中結構復雜、功能活躍的混合物。由于腐植酸具有特殊的分子結構和生物學功能，作為飼料添加劑在水產和畜禽養殖上已經有廣泛應用[1～9]。

本文對腐植酸、豆粕和玉米漿粉通過微生物發酵生產出的腐植酸發酵肽與枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參和基圍蝦混合養殖中的增產效果進行研究，旨在為腐植酸類飼料添加劑的利用及腐植酸類凈水劑和微生態制劑的應用提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

（1）枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis 2018），從遼寧大連黃海海域底泥中分離得到。

（2）釀酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae CICC 1421），從中國工業微生物保藏管理中心購買。

（3）嗜酸乳桿菌（Lactobacillus Acidophilus CICC 6074），從中國工業微生物保藏管理中心購買。

1.1.2 供試原料

（1）腐植酸，從內蒙古霍林河郭勒樹艷腐植酸公司定購，腐植酸含量≥60%，細度≤80目，水份≤15%，pH=5.0。

（2）玉米漿粉，山東西王集團有限公司生產，市售，蛋白質含量≥42%，碳水化合物（糖）≥8.0%，總磷含量≥1.0%，灰分≤5.0%，水分≤6.0%，細度≤100目。

1.1.3 供試設備

發酵罐，匯森生物設備（鎮江）有限公司生產；固體發酵機組，中國水產科學院上海漁用機械研究所研制生產；低溫負壓流化床，中國水產科學院上海漁用機械研究所研制生產。

1.1.4 供試苗種

海刺參、基圍蝦，由山東東營海躍水產生物科技有限公司自繁。

1.2 腐植酸發酵肽產品制備工藝

腐植酸發酵肽產品制備工藝：液體發酵→固體發酵→烘干粉碎→產品保證值檢測。

（1）液體發酵工藝過程：1支試管斜面→1000 mL三角搖瓶10瓶（搖床培養24 h）→1 t種子罐（24 h）→10 t發酵罐（36 h）。

將選用的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌菌株分別在各自的發酵罐中培養，各發酵罐所選用培養基、發酵條件及發酵結果見表1。

（2）固體發酵工藝過程：3 t旋轉蒸球高溫高壓處理固體發酵物料→物料冷卻后與發酵菌液混合→傳送帶機械鋪料→采用流動履帶式全自動發酵機組發酵。

固體發酵物料配比：腐植酸40份，豆粕30份，玉米漿粉30份。

發酵菌液配比：枯草芽孢桿菌15份、釀酒酵母15份、嗜酸乳桿菌份15份。

將固體發酵原料與發酵菌液，按照100∶45混合，混勻后，均勻的平鋪到流動履帶式全自動發酵器上進行100 h發酵。

（3）烘干粉碎過程：傳送系統→負壓式低溫真空流化床→傳送系統→大型微粉機械→多級篩過篩→傳送系統→成品包裝→質檢→腐植酸發酵肽產品。

固體發酵完成后對所得產物在負壓式低溫真空流化床進行烘干，烘干的條件是，進風溫度80 ℃，出風溫度35 ℃，流化時間12 min，含水量12.0%，粉碎、過篩目數100目。

（4）產品保證值檢測：粗蛋白檢測按照國家標準GB/T 6432-1994飼料中粗蛋白測定方法[10]進行測定；氨基酸檢測按照國家標準GB/T 18246-2000飼料中氨基酸測定方法[11]進行測定；小肽檢測按照國家標準GB/T 22492-2008飼料中酸溶蛋白方法[12]進行測定，小肽分子量小于2000道爾頓；抗原檢測按照發酵豆粕中抗原蛋白的定性檢測方法——sds-PAGE方法[13]進行測定；乳酸檢測按照國家標準GB 1886.173-2016中乳酸測定方法[14]進行測定。

表1 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌液體發酵所需培養基、發酵條件Tab.1 The culture medium and fermentation conditions of Bacillus Subtilis, Saccharomyces Cerevisiae,Lactobacillus Acidophilus liquid fermentation

1.3 試驗設計

1.3.1 海刺參與基圍蝦大面積混養

試驗組1：養殖場2（1200畝），養殖場5（1300畝），養殖場6（1150畝）；腐植酸發酵肽5千克/畝、枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝用量，在水溫平均達到18 ℃以上后，按潮汐規律，每半月投撒一次；試驗期間共應用10次。

試驗組2：養殖場1（1000畝），養殖場3（1000畝），養殖場7（1000畝）；腐植酸發酵肽10千克/畝、枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝用量，在水溫平均達到18 ℃以上后，按潮汐規律，每半月投撒1次；試驗期間共應用10次。

對照組：養殖場4（1250畝），養殖場8（1000畝），養殖場9（1100畝）。枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝、腐植酸10千克/畝用量，水溫平均達到18 ℃以上后，按潮汐規律，每半月投撒一次；試驗期間共應用10次。

1.3.2 海刺參大面積養殖

試驗組：腐植酸發酵肽按照10%劑量拌入海刺參餌料中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達到18 ℃以上，按潮汐規律，試驗期應用2次。

對照組：腐植酸按照10%劑量拌入海泥中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達到18 ℃以上，按潮汐規律，試驗期應用2次。

1.3.3 基圍蝦大面積養殖

試驗組：腐植酸發酵肽按照10%劑量拌入基圍蝦餌料中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，水溫平均達到18 ℃以上，按潮汐規律，試驗期應用2次。

對照組：腐植酸按照10%劑量拌入海泥中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達到18 ℃以上，按潮汐規律，試驗期共應用2次。

1.3.4 試驗時間、地點、管理及經濟效益分析

試驗時間：海刺參與基圍蝦大面積混合養殖是2017年5月1日—11月1日，為期180天；海刺參大面積養殖是2017年5月10日—6月10日，為期30天；基圍蝦大面積養殖是2017年8月1日—10月1日，為期60天。

試驗地點：山東東營海躍水產生物科技有限公司養殖場。

日常管理：按照試驗設計投撒腐植酸發酵肽和微生物制劑，巡塘、換水、滅草等項管理措施，按照正常管理進行。在山東東營地區海刺參最佳生長時間為4月15日—6月15日、9月1日到11月1日。海刺參最適生長溫度為20±5 ℃，25 ℃以上高水溫期有夏眠習性。

飼料報酬率：也稱耗料增重比、料重比、料肉比、飼料消耗比。即每生產單位重量的產品所耗用飼料的數量。

經濟效益分析：按照經濟效益計算公式，試驗凈效益=試驗增加收入－試驗投入費用。

試驗增加費用：腐植酸發酵肽、腐植酸、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌所投入費用。

2 結果與分析

2.1 腐植酸發酵肽的生產

2.1.1 液體發酵

按照表1選用的培養基、發酵條件，經過36 h的發酵，生產出枯草芽孢桿菌≥2×1010個/毫升、釀酒酵母≥3×109個/毫升、嗜酸乳桿菌≥8×109個/毫升的菌液。

2.1.2 固體發酵

經固體發酵得到含水量≤10%、枯草芽孢桿菌≥6×1010個/毫升、釀酒酵母≥1.5×109個/毫升、嗜酸乳桿菌≥2.5×109個/毫升的腐植酸發酵肽。

2.1.3 腐植酸發酵肽的產品保證值

通過上述工藝生產出的腐植酸發酵肽的產品，其產品與腐植酸有區別，通過產品保證值檢測，結果見表2。

表2 腐植酸發酵肽與腐植酸的區別及其產品保證Tab.2 The difference of humic acid fermentation peptide with humic acid and its products guarantee value

2.2 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在

海刺參與基圍蝦大面積混養中的應用

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參基圍蝦混養中成活率及產量的影響結果，見表3。

經方差分析海刺參重量：試驗組1與對照組比較：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差異顯著；試驗組2與對照組比較：P=0.0088，P≤0.01，差異極顯著；試驗組1與試驗組2比較：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差異顯著。

經方差分析基圍蝦重量：試驗組1與對照組比較：P=0.0467，0.01≤P≤0.05，差異顯著；試驗組2與對照組比較：P=0.0021，P≤0.01，差異極顯著；試驗組1與試驗組2比較：P=0.0438，0.01≤P≤0.05，差異顯著。

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦混養中的應用結果，通過表3可以看出，試驗組1海刺參平均196.9千克/畝，基圍蝦平均17.5千克/畝；試驗組2海刺參平均206.1千克/畝，基圍蝦平均19.6千克/畝；對照組海刺參平均160.4千克/畝，基圍蝦平均15.6千克/畝。與對照組相比，試驗組1海刺參增重率22.76%，基圍蝦增重率12.18%；試驗組2海刺參增重率28.49%，基圍蝦增重率25.64%。

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦混養中的經濟效益分析結果見表4。可以看出，試驗組1投入成本增加400元/畝，試驗增加收入3880元/畝，凈收益增加3480元/畝；試驗組2投入成本增加900元/畝，試驗增加收入 4950元/畝，試驗凈收益增加4050元/畝。

表3 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參、基圍蝦混養成活率及產量的影響（春秋2季）Tab.3 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and yield of sea cucumbers and shrimps mixed breeding (spring and fall)

表4 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參、基圍蝦混養中的經濟效益分析Tab.4 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on sea cucumbers and shrimps mixed breeding

2.3 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參大面積養殖中的應用

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參養殖中對海刺參成活率及增重的影響，試驗結果及其數據分析見表5。

經過方差分析：試驗組與對照組比較，P=0.0092，P≤0.01，差異極顯著。

通過表5可以看出，在海刺參大面積養殖中，試驗組增重量39.3千克/畝、成活率52.08%、飼料報酬率1.102；對照組增重量27.1千克/畝、成活率45.41%、飼料報酬率1.600。與對照組相比，試驗組海刺參增重率45.02%、成活率提高6.67個百分點，飼料報酬率降低0.498。

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參大面積養殖的經濟效益分析見表6。

通過表6可以看出，試驗組投入成本增加180元/畝，收入增加1220元/畝，試驗增加凈收益1040元/畝。（投入的海刺參餌料100元沒有計入到投入費用中）。

2.4 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在

基圍蝦大面積養殖中的應用

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對基圍蝦成活率及增重影響，試驗結果及其數據分析見表7。

經過方差分析：試驗組與對照組比較：P=0.0065，P≤0.01，差異極顯著。

通過表7可以看出，在基圍蝦大面積養殖中，試驗組增重量18.5千克/畝、成活率44.7%、飼料報酬率0.720；對照組增重量14.2千克/畝、成活率20.3%、飼料報酬率0.941。與對照組相比，試驗組基圍蝦增重率30.28%、成活率提高24.4個百分點，飼料報酬率（FCR）降低0.221。

腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在基圍蝦大面積養殖的經濟效益分析結果見8。

通過表8可以看出，試驗組1投入成本增加180元/畝，收入增加430元/畝，試驗增加凈收益250元/畝。（投入的基圍蝦餌料50元沒有計入到投入費用中）。

表5 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參成活率及增重的影響（30天）Tab.5 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of sea cucumbers (30 days)

表6 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參養殖中經濟效益分析Tab.6 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in sea cucumbers breeding

表7 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對基圍蝦成活率及增重的影響（60天）Tab.7 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of shrimps (60 days)

表8 腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在基圍蝦養殖中的經濟效益分析Tab.8 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in shrimps breeding

3 結論

（1）腐植酸是一種存在于自然界中結構復雜功能活躍的混合物，泥炭腐植酸中存在少量的蛋白質、氨基酸和小肽，而礦源腐植酸中沒有。腐植酸作為飼料添加劑主要是利用其具有的特殊分子結構和生物活性物質。將腐植酸、豆粕、玉米漿粉按3∶4∶3比例混合，以枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌為發酵菌種，經液體制菌、固體發酵、低溫烘干、微粉碎等生產工藝，得到的腐植酸發酵肽，其主要物理性狀、化學性質和微生物含量測定指標：蛋白質38%，小肽10%，賴氨酸3.0%，細度≤100目，含水量≤10%，枯草芽孢桿菌≥6×109個/毫升，釀酒酵母≥1.5×109個/毫升，嗜酸乳桿菌≥2.5×109個/毫升。

（2）腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦大面積混養中進行應用試驗，結果表明：海刺參增重率22.76%～28.49%，基圍蝦增重率12.18%～25.64%；試驗凈收益增加3480～4050元/畝；海刺參大面積養殖中，試驗結果表明：海刺參增重率45.02%、成活率提高6.67個百分點，飼料報酬率（FCR）降低0.498，試驗凈收益增加1040元/畝。基圍蝦大面積養殖中，試驗結果表明：基圍蝦增重率30.28%、成活率提高24.4個百分點，飼料報酬率（FCR）降低0.221，試驗凈收益增加250元/畝。從經濟效益分析中可以看出，在海刺參與基圍蝦大面積混養中，應用腐植酸發酵肽、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌，經濟效益增加最多，海刺參大面積養殖次之。

（3）腐植酸發酵肽和枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，作為生物飼料添加劑，可為海刺參與基圍蝦提供小分子的多肽、氨基酸和氮素營養，可以降低養殖水體中的銨態氮、硝態氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質的濃度，有效地清除池底積累的殘余餌料和排泄廢棄物，有效地改善水質。并能促進單細胞微藻的生長，調節藻菌相，降低透明度，抑制光合作用，從而控制多細胞大型澡類的生長，結合枯草芽孢桿菌能分泌蛋白酶等酶類，可起到控草作用，使養殖水體形成一個良性生態循環體系。

綜上所述，腐植酸發酵肽和枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，作為綠色環保型生物飼料添加劑在海刺參與基圍蝦大面積混養中應用潛力巨大，經濟效益顯著，作為綠色環保型飼料添加劑廣泛推廣應用，必將對我國水產養殖業作出重要貢獻。

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