組蛋白去乙酰化酶突變體水解酰基底物的研究

宮艷超，褚文瑋，趙偉偉

（天津渤海職業技術學院生物與環境工程系，天津300402）

蛋白質的翻譯后修飾與基因轉錄有著密切的關系，其中，蛋白質的乙酰化與去乙酰化修飾是由組蛋白去乙酰化酶（HDACs）和組蛋白乙酰化酶（HAT）協同調控的[1]。它們通過調節賴氨酸殘基末端的電荷狀態，改變蛋白質的結構與功能[2]。

蛋白質的翻譯后修飾，在生物體內具有重要的生理功能。目前，體內已經發現了200多種翻譯后修飾[3]。除了組蛋白的N-乙酰化修飾，超過1700個人源蛋白被發現是N-乙酰化修飾的底物蛋白[4]，蛋白的酰基化修飾最常見的就是賴氨酸殘基末端的乙酰化修飾，除了常見的蛋白質賴氨酸的乙酰化修飾，最近還發現了丙酰化修飾、丁酰化修飾、丙二酰修飾以及巴豆酰化修飾等[5]，但是這些修飾的生理功能以及如何影響基因的調控過程并不清楚[6]。

HDAC家族的蛋白結構分析可以得出，其酶活中心由兩個loop組成，組成水解醋酸根的逃逸通道，loop1（藍色），具有高度保守的GG序列，loop2(粉紅色)，具有核心保守序列HH，家族1和家族3，在該酶活中心是GGX-，其中，X是較大的殘基，酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），家族2在該酶活中心的序列為PPX-，X位置為較小的甘氨酸（Gly）。以野生型組蛋白去乙酰化酶（HDAC8）為例，GGXHH motif X的位置是色氨酸（Trp），141位的色氨酸位于醋酸根逃逸通道的和酶活中心位置，距離乙酰基只有4 ?左右。

因此，本實驗以141位色氨酸為突變位點，分別突變為丙氨酸（Ala）、Gly、組氨酸（His）和 Phe，發現其對酰基底物（A0=Ac-Arg-His-Lys-Lys(Z)-AMC,Z為乙酰）的水解能力較野生型變弱，得出HDAC8的141氨基酸所占空間位置的大小，影響其酶活性。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

實驗室保存的pET-22b-hHDAC8為實驗中所用HDAC8質粒，用于質粒擴增的菌株E.coli trans 5α（DH 5α）感受態細胞和用于表達蛋白的菌株BL21(DE3)感受態細胞購買于全式金生物技術有限公司，所用細胞株Hela細胞由實驗室凍存。

1.2 儀器與試劑

Millipore型純水儀（蘇州賽恩斯儀器有限公司）、BS124S天平（德國 Sartorius）、YC-2層析實驗冷柜（北京博醫康實驗儀器有限公司）、AKTA蛋白純化儀（通用醫療生命科學上海有限公司）、Hitrap Q離子交換柱（通用醫療生命科學上海有限公司）、Superdex 200分子篩柱（通用醫療生命科學上海有限公司）、還原型谷胱甘肽（上海生工生物工程有限公司）、氯化鈉（上海生工生物工程有限公司）、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司）、酵母粉（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 pET-22b-hHDAC8質粒的定點突變

將pET-22b-hHDAC8的141位Trp定點突變為為 Gly,Ala，Phe，His，并設計其引物，進行突變。

1.3.2 pET-22b-hHDAC8的表達純化

pET-22b-hHDAC8及其突變體的表達，目的質粒轉化到表達菌株BL-21中，取1 μL測序正確的目的質粒加入50 μL感受態細胞BL-21中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰浴5 min，加入850 μL LB培養基，37℃ 220 rpm振蕩 90 min，4000 rpm離心6 min，棄去部分上清，重懸涂于含氨芐100 mg/L LB固體培養基上，37℃過夜培養。挑取陽性單克隆加入含氨芐的LB液體培養基中37℃振蕩，過夜培養12 h左右。次日將過夜培養菌液加入1 LLB液體培養基（含氨芐100 mg/L）中，于37℃振蕩培養，4～6 h后加入0.4 mM IPTG誘導表達，繼續16℃培養18 h后收取菌體。

離子交換層析（Hitrap Q柱），按系統操作執行進行洗泵，結束后將泵頭A、B分別放入到抽濾過的His-HDAC8離子交換低鹽緩沖液和His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液中，設置流速，接離子柱，高低鹽各處理離子柱三次，最后用5%的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液平衡離子柱，上樣，待樣品進入系統內后，將模式由Inject改為Load,將鹽濃度改為15%的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液，用15%～35%質量分數的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液進行梯度洗脫，1 mL/tube進行適當收集，SDS-PAGE跑膠鑒定。

凝膠過濾層析（Superdex 200），按系統操作執行進行洗泵，結束后將泵頭A、B放入到抽濾過的His-HDAC8分子篩緩沖液中，設置流速，接柱，用His-HDAC8分子篩緩沖液平衡Superdex 200，上樣，切換模式，并開始收集0.5 mL/tube，SDSPAGE跑膠鑒定。

1.3.3 人源HDAC8蛋白及突變體與酰基底物的酶活測試

純化的蛋白用紫外分光光度計測定濃度使其濃度2 mg/mL，在黑色96孔熒光板中分別加入40μL濃度為 150μM的 AMC熒光多肽底物，10 μL四種不同突變型的HDAC8酶液和50μL Assay buffer，于37℃恒溫振蕩反應30 min，注意避光，加入 100μL含10 mg/mL胰酶和200μM SAHA的Trypsin solution終止上述反應，并在37℃恒溫振蕩器中振蕩反應30 min后，在酶標儀中于390 nm/460 nm熒光波長下測定熒光強度，分析數據。

2 結果與討論

2.1 pET-22b-hHDAC8質粒的定點突變

以pET-22b-hHDAC8為模板，將HDAC8突變成 pET-22b-hHDAC8-W141G、pET-22b-hHDAC8-W141A、pET-22b-hHDAC8-W141F、pET-22b-hHDAC8-W141H,突變后測序結果如下，由測序結果可以看出，本實驗需要的位點都實現了定點突變，可以將質粒轉化到表達型的菌株，實現后續的表達純化。

2.2 pET-22b-hHDAC8及其突變體的表達純化

2.2.1 pET-22b-hHDAC8的表達純化

本實驗將人源的HDAC8蛋白，經超聲破碎前，取平衡緩沖液內全菌的樣，確定目的蛋白是否在大腸桿菌內表達，超聲破碎后，取高速離心后的上清和沉淀的樣，上清液掛住，分別取穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，只有少量目的蛋白殘留于柱料上，HDAC8蛋白的親和層析各步驟的結果如圖1。

由圖1所見，由于HDAC8蛋白的相對分子質量量約43，所以由親和層析圖可以看出：HDAC8蛋白出現在洗脫樣品中，可以進行下一步實驗。

圖1 pET-22b-hHDAC8鎳柱親和純化SDS-PAGE結果

用10mL KD的濃縮管將HDAC8蛋白的洗脫液濃縮到小體積，由于洗脫buffer含有200 mM的咪唑，300 mM KCl，所以離子交換層析之前，利用buffer，將咪唑換到1 mM以下，300 mM KCl換到50 mM KCl，如圖2。

圖2 pET-22b-hHDAC8 HitrapQ離子交換純化峰圖

我們將洗脫液經過換buffer之后濃縮到1.5 mL，采用陰離子交換柱Hitrap Q進行純化，平衡離子柱的濃度為50 mM KCl，蛋白洗脫之前將鹽濃度拉至150 mM KCl，洗脫目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl，初期的上樣過程蛋白有穿透峰，當電導為24 mS/cm左右時，即開始出現目的蛋白峰，SDS-PAGE結果顯示11管-18管均為目的蛋白，取11-18管進行下一步純化，如圖3。

取第11-18管用10 mL KD濃縮管進行濃縮，濃縮到500 μL左右的時候，使用Superdex 200進行純化，平衡Superdex 200，保持離子濃度在150 mM KCl，上樣，洗脫，從10 mL左右出現了雜峰，14 mL左右開始出現目的蛋白峰，峰形單一對稱，按照峰寬收集蛋白跑膠，SDS-PAGE結果顯示19～24 管均為目的蛋白 HDAC8（43 KD），取第 19～24管進行濃縮，-80℃備用，如圖4。

圖3 pET-22b-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換SDSPAGE結果

圖4 pET-22b-hHDAC8 Superdex 200分子篩SDS-PAGE結果

2.2.2 pET-22b-hHDAC8-W141G的表達純化

本實驗純化四種突變體蛋白，以甘氨酸突變體為例，將HDAC8-W141G蛋白，經超聲破碎前后，分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣，洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白，幾乎無目的蛋白殘留于柱料上，HDAC8-W141G蛋白的親和層析各步驟的結果如圖5。

圖5 pET-22b-hHDAC8-W141G鎳柱親和純化SDS-PAGE結果

由圖5可見：由于HDAC8蛋白的相對分子質量約43左右，所以由親和層析圖可以看出，HDAC8蛋白出現在洗脫樣品中，可以進行下一步的實驗。

我們將洗脫液經過換buffer之后濃縮到1.5 mL，采用陰離子交換柱Hitrap Q進行純化，平衡離子柱的濃度為50 mM KCl，蛋白洗脫之前將鹽濃度拉至150 mM KCl，洗脫目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl，初期的上樣過程蛋白有穿透峰，當電導為24 mS/cm左右時，即開始出現目的蛋白峰。SDS-PAGE結果顯示13管-23管均為目的蛋白，取13-23管進行下一步純化，如圖6。

圖6 pET-22b-hHDAC8-W141G Hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結果

取第 13～23管用10 mL KD濃縮管進行濃縮，濃縮到500 μL左右的時候，使用Superdex 200進行進一步的純化，平衡Superdex 200，保持離子濃度在150 mM KCl，上樣，洗脫，從 10 mL到 13 mL出現了雜峰，13 mL左右開始出現目的蛋白峰，峰形單一對稱，按照峰寬收集蛋白跑膠，SDSPAGE結果顯示20～24管均為目的蛋白HDAC8（43），取第 20～24管進行濃縮，-80℃備用，如圖7。

圖7 pET-22b-hHDAC8-W141G Superdex 200分子篩SDS-PAGE結果

2.3 野生型及突變型hHDAC8蛋白對AMC熒光多肽底物的水解效果

本實驗的實驗思路是通過酶學測試，觀察野生型HDAC8蛋白及四種突變體對熒光底物的水解能力差異，驗證HDAC8的141位與酰基的結合關鍵點，純化的HDAC8蛋白及其突變體用紫外分光光度計測定蛋白濃度，使蛋白終濃度為0.2 mg/mL，AMC熒光多肽底物的濃度為150 μM，其它反應時間和終止時間都一致，結果數據顯示如圖8。

圖8 HDAC8蛋白野生型及其突變體對AMC酰化底物的水解

由圖8可見：A0為乙酰化AMC四肽底物，野生型的HDAC8對其水解能力最強，四種突變體對該AMC酰基底物水解能力都變弱了，說明141位色氨酸的突變影響了HDAC8的酶活力。

3 結論

在HDAC8蛋白野生型的基礎上，將其酶活中心逃逸通道位置的141位的色氨酸分別突變為Ala、Gly、His和 Phe，突變成較小和較大的氨基酸，并純化表達出相應的野生型和突變體蛋白，然后與AMC熒光底物A0測定酶活性，發現其對酰基底物的水解能力較野生型變弱，因此，得出HDAC8的141氨基酸所占空間位置的大小，影響其酶活性的結論。

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