基于宏基因組方法分析養豬發酵床微生物組季節性變化

陳倩倩，劉 波，王階平，朱育菁，張海峰

（福建省農業科學院農業生物資源研究所，福州 350003）

微生物發酵床以谷殼、秸稈、鋸糠、椰糠等農業副產品作為墊料層，禽畜養殖于其上，日常墊料管理和動物拱翻混合墊料與豬糞尿等排泄物，微生物對混合物進行發酵，進而消納糞便、去除異味，實現無害化養殖，是一種新型環保養豬技術。微生物發酵床的應用可追溯至明崇禎年間，養殖者以碎草和土為墊圈材料，與糞尿充分混合，形成一種廄肥[1]。1970年，日本建立了以木屑為墊料的微生物發酵床系統[2]。1985年加拿大Biotech公司發明以秸稈為墊料的微生物發酵床系統[3]。20世紀90年代末期，微生物發酵床在日本、中國、韓國及其他東南亞國家推廣。此后，研究者一直對發酵床系統進行改良和升級。Chan等[4]為了解決夏季高溫的難題，進行了發酵床的改良，提高動物福利。Deininger等[5]采用破碎處理的秸稈作為發酵床墊料，其處理糞便效果和提高動物福利方面優于未處理的秸稈。Kapuinen等[6]測定了不同有機墊料的鋪填厚度、承載容量、透氣能力、耐壓程度等指標，發現將泥炭、木屑和稻秸按一定的比例混合后使用，其效果優于單純的有機墊料。

微生物發酵床墊料中的微生物消納處理畜禽糞便，細菌在降解過程中起重要作用。早期發酵床微生物研究主要依賴于傳統分離培養法。趙國華等[7]采用常規的分離培養法研究了養豬發酵床墊料中微生物群落構成，芽胞桿菌為墊料中的優勢菌，起著降解墊料有機質的作用，隨著發酵床壽命的延長，其中的微生物群落多樣性逐漸降低。王震等[8]同樣發現芽胞桿菌是發酵床墊料中的優勢細菌，并參與豬糞降解與發酵床病原生防過程。依靠分離培養技術，大量的除臭菌、豬糞降解菌得以更深入的研究與應用。但該方法操作周期長，過程繁瑣，很難完全分離到墊料中的不可培養的厭氧菌及特殊營養類型微生物。脂肪酸標記法與PCR-DGGE技術無分離培養過程，能夠較為全面揭示微生物多樣性。劉波等[9]采用微生物群落脂肪酸生物標記分析了零排放豬場基質墊層多樣性，共檢測出37個墊料微生物生物標記。宦海琳等[10]采用PCR-DGGE技術對發酵床墊料基質中的細菌群落多樣性進行研究，結果表明墊料中的主要菌群是節桿菌屬、放線菌屬、芽胞桿菌屬和梭菌屬等，墊料的組成影響其中的微生物群落結構。隨著測序技術的發展，宏基因組測序技術成為研究微生物之間以及微生物與環境因子之間互作的有力工具。該技術繞過傳統純培養技術的瓶頸，研究包含特定生境中微生物的全部遺傳信息，更全面地揭示微生物多樣性[11]。

發酵床墊料中的微生物菌群可分解豬糞尿、抑制病原菌，是發酵床的核心，其種類和數量對發酵床的運行至關重要。利用宏基因組技術研究發酵床微生物變化，能夠揭示微生物群落的細菌種類、數量及結構，對于發酵床降解糞污及除臭等功能研究極其重要。在堆肥研究中，Ren等[12]采用16S rRNA基因序列高通量測序技術分析牛糞堆肥中的微生物組結構與變化，發現主要的細菌為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門及放線菌門，并且發酵各階段具有不同的細菌群落。筆者前期研究發現，在發酵的不同階段，墊料中的優勢微生物不同，隨著發酵時間延長，棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、放線菌屬、乳桿菌屬含量增加[13]。但是基于宏基因分析養豬發酵床微生物組季節性變化研究鮮見報道。溫度影響細胞內的生化反應，如微生物細胞的酶活性、細胞質膜流動性及環境因子（如物質溶解度）等，進而影響微生物的生長和代謝。因此采用Illumina二代測序技術，研究夏季高溫與冬季低溫脅迫下發酵床墊料細菌微生物組多樣性，可為夏、冬季節發酵床的維護和發酵床豬糞的生物降解提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗地點：微生物發酵床位于福建省福清漁溪現代設施農業樣本工程示范基地。發酵床厚度為80 cm，微生物組采樣季節選擇夏季和冬季，發酵床夏季和冬季樣本采集方法：夏季樣本取自微生物發酵床7月份表層墊料，冬季樣本取自同年12月份微生物發酵床表層墊料。采用五點取樣法采集，同時進行3次重復采樣，混合每次采集的墊料，進行細菌多樣性研究。墊料由70%椰糠和30%谷殼粉構成，厚度為80 cm。墊料的管理采用兩天旋耕一次，兩周翻犁一次，兩月深鉤一次，并根據墊料濕度的變化調整新鮮墊料的添加。本次夏季和冬季墊料的采樣深度為0～15 cm，含水量為45%左右。7月份發酵床室內平均溫度為30.13℃，12月份為15.67℃。夏季樣本記為s1、s2和s3；冬季樣本記為w1、w2和w3。

1.2 方法

1.2.1 微生物發酵床墊料總DNA的提取

按土壤DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil的操作指南，稱取500 mg墊料樣本分別進行總DNA的提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA濃度，稀釋至終濃度為1 ng·μL-1開展后續試驗。

1.2.2 微生物組16S rDNA V3-V4區測序

采用原核生物16S rDNA基因V3-V4區通用引物 338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′對各墊料樣本總DNA進行PCR擴增，PCR反應重復3次。取相同體積混合后進行目的片段回收，所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）。采用 QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）對回收產物進行定量檢測。然后構建插入片段為 350 bp的 Paired-End（PE）文庫（TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒，Illumina公司），經過Qubit定量和文庫檢測，HiSeq上機測序（上海美吉）。

1.2.3 微生物組測序數據質控與分析

對測序得到的原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據。采用Mothur軟件（Version 1.36.1）基于有效數據進行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析[14]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析[15]。從各個OTU中挑選出一條序列作為該OTU的代表序列，將該代表序列與已知物種的16S數據庫（Silva，http：//www.arb-silva.de）進行物種注釋分析；根據每個OTU中序列的條數，得到各個OTU的豐度值[16-17]。反映組間各樣品之間的共有及特有OTU數目的Venn圖，采用VennDiagram軟件生成[18]。

相應的數據釋放與SRA（Sequence Read Archive）數據庫，序列號分別為 SRR5611215（S1），SRR5611214（S2），SRR5611217（S3），SRR5611216（W1），SRR5611223（W2）和 SRR5611222（W3）。

1.2.4 微生物發酵床細菌群落結構季節變化差異分析

選取含量前9的細菌門和前12的細菌屬分別比較兩個季節在門和屬水平上的差異。采用RDA（冗余分析）法，基于線性模型研究溫度、墊料、菌群三者之間的關系。在RDA圖內，環境因子用箭頭表示，箭頭連線和排序軸的夾角代表某個環境因子與排序軸的相關性大小，夾角越小，相關性越高；反之相關性越低。環境因子之間的夾角為銳角時表示兩個環境因子之間呈正相關關系，不出現銳角時呈負相關關系。

1.2.5 微生物發酵床細菌群落PICRUSt基因預測

16S功能預測是通過PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）對OTU豐度表進行標準化[19]，根據KEGG數據庫的信息，獲得各功能基因的豐度，推測微生物群落的功能信息。PICRUSt首先根據微生物16S rRNA信息推測親緣關系最近的微生物，根據其宏基因組預測其他基因片段的功能，與數據庫比對獲得微生物群落的代謝功能。經PICRUSt分析，絕大多數微生物預測結構與真實基因功能圖譜非常相近，但對于無法用數據庫比對獲得同源物種信息的微生物則無法預測其功能。分析獲得KEGG代謝通路包含3個水平信息，本文采用level2水平進行分析。

2 結果與分析

2.1 微生物發酵床細菌種類季節變化差異

夏季和冬季發酵床6個樣本共獲得762 923個有效序列。所有樣本的稀釋曲線接近平臺（圖1），測序深度已經基本覆蓋樣本中的所有物種，覆蓋率高。韋恩圖（圖2）顯示，夏季樣本包含1741種OTUs，冬季樣本包含1677種OTUs，夏季樣本有更豐富的細菌種類。2組樣本共有的OTU有1575個，其中夏季特有OTU 166種，占夏季總OTU的9.5%；冬季特有OTU有102種，占冬季總量的6.1%。夏冬墊料6個樣本中共檢測到1843種OTU類型，其中夏季樣本包含34門，70綱，139目，258科，566屬和 889種細菌；冬樣本包含28門，59綱，124目，231科，525屬和832種細菌。夏季微生物發酵床具有更為豐富和多樣的細菌類群。

2.2 微生物發酵床細菌群落結構季節變化差異

微生物發酵床主要的細菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和糖桿菌門（圖3）。夏季樣本中，主要細菌為擬桿菌門（28.3%）、厚壁菌門（20.7%）、放線菌門（19.8%）和變形菌門（10.4%）。冬季發酵床墊料的主要細菌為擬桿菌門（31.6%）、厚壁菌門（28.1%）和變形菌門（22.3%）。其中，異常球菌-棲熱菌門在微生物發酵床夏季樣本中的含量為冬季樣本的10倍。夏季墊料中的放線菌門、綠彎菌門和螺旋菌門含量也明顯高于冬季樣本。而變形菌門在冬季樣本中的含量遠高于夏季樣本，為后者的2倍。擬桿菌門和厚壁菌門含量也明顯高于夏季樣本。

圖1 測序樣品稀釋曲線Figure1 Rarfaction curve of samples

圖2 OTU水平的韋恩圖Figure2 Venn diagram on OTU level

通過對細菌門水平的研究，發現夏、冬兩個季節微生物發酵床墊料中的細菌群落結構不同，細菌分布與溫度相適應。夏季中耐熱細菌含量多，包括放線菌門、異常球菌-棲熱菌門、綠彎菌門和螺旋菌門，并且具有更豐富的細菌種類。冬季，在各種生境中廣泛分布的擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門含量高。

在屬水平上，兩個季節的墊料共檢測到581個細菌屬，其中夏季樣本包含566個屬，393 210 reads；冬季樣本包含525屬，369 713 reads。選取兩個季節樣本中含量前12的屬，比較其在兩個季節中的差異（圖4）。夏季樣本中的主要細菌為糖桿菌屬（6.5%）、漠河桿菌屬（8.8%）和特呂珀菌屬（7.4%）。冬季樣本中含量較多的為糖桿菌屬（7.1%）、硫假單胞菌（6.8%）、寡源桿菌屬（3.5%）和嗜蛋白菌屬（3.8%）。異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌屬在夏季樣本中的相對含量為冬季樣本的10倍；擬桿菌門的漠河桿菌是冬季樣本的13.2倍。假單胞菌科的硫假單胞菌在冬季樣本中的相對含量為夏季樣本的25倍。發酵床冬季樣本中擬桿菌門的普氏菌屬-9、鏈球菌屬、黃桿菌屬和嗜蛋白菌屬高于發酵床夏季樣本，分別是夏季樣本的3.7、9.6、5.2、3.4、1.9 倍。

圖3 微生物發酵床墊料在門水平的微生物組成及相對豐度Figure3 Relative abundances of predominant bacterial compositions on phylum level

圖4 微生物發酵床墊料在屬水平的微生物組成及相對豐度Figure4 Relative abundances of predominant bacterial compositions on genus level

2.3 微生物發酵床細菌群落季節變化熱圖分析

通過對不同分類水平的微生物進行多樣性分析，選擇含量前50的細菌屬，根據它們在發酵床夏季和冬季墊料樣本中豐度比例結構建立熱圖（圖5）。按季節不同，樣本聚成兩類：夏季樣本（s1、s2和s3）和冬季樣本（w1、w2和w3），說明相同季節的微生物發酵床墊料具有相似的微生物構成。根據豐度差異，細菌可聚成3類。第1類為在微生物發酵床夏季和冬季樣本中含量低的細菌，包含葡萄球菌屬、短桿菌屬和涅斯捷連科氏菌等7個屬。第二類為夏季樣本含量高的降解菌，包括嗜熱菌特呂珀菌屬、漠河桿菌屬、紫單胞菌科、間孢囊菌科及微球菌目的細菌。第三類為冬季樣本含量較高的細菌屬，其中可分為3亞類。硫假單胞菌屬和糖桿菌屬含量最高；第二亞類包含嗜蛋白菌屬、海洋桿菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬等9個屬的細菌，多為適冷菌；第三亞類包含假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、黃桿菌屬等降解菌。

異常球菌-棲熱菌門在夏季發酵床含量高，此門細菌包含異常球菌目和棲熱菌目2個目，具有厚的細胞壁結構，能夠抵抗嚴酷環境。在微生物發酵床中分離到的該門細菌有異常球菌目的特呂珀菌屬。放線菌門在夏季微生物發酵床中的含量也明顯高于冬季樣本，為冬季的3.5倍。放線菌是自然界中重要的降解菌，可降解多種有機物。擬桿菌門的漠河桿菌屬含量也高于冬季樣本。

變形菌門細菌在冬季發酵床中含量高。微生物發酵床的該門細菌主要包括：β-變形菌的寡源桿菌屬和γ-變形菌的假單胞菌屬、硫假單胞菌屬、海洋桿菌屬等，其中假單胞菌屬和硫假單胞菌含量高于夏季樣本。冬季樣本中擬桿菌門也具有數量優勢，是夏季樣本的2倍多。擬桿菌門的嗜蛋白菌屬、冬季微菌屬和黃桿菌屬在冬季發酵床中的含量分別為夏季樣本的1.8、2.1、5.2 倍。

圖5 細菌在各樣本間的分布熱圖（屬水平）Figure5 Hierarchically clustered heatmap of bacterial distribution of different communities from the samples on the genus level

2.4 微生物發酵床細菌群落季節變化關聯分析

RDA法分析結果反映了墊料菌群與季節性溫度之間的關系。結果（圖6）顯示，細菌門的分布與溫度相關。分析結果可以看出：①溫度與放線菌門含量夾角為銳角，呈正相關，隨溫度升高而增加，在夏季發酵床含量高達19.8%，而冬季含量則為12.7%；②溫度與厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門的含量為鈍角，呈負相關，3個門細菌含量隨溫度降低而增加，在冬季樣本中含量較高，分別是夏季樣本的1.4、2.1、1.1倍；③放線菌與厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門菌量之間為鈍角，呈負相關，隨著溫度升高放線菌含量增加，夏季發酵床中的放線菌含量是冬季墊料的1.6倍，而厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門含量分別降低了27.3%、53.4%和10.4%；④厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門之間呈銳角，呈正相關，它們在夏季和冬季發酵墊料中的含量變化一致。

圖6 墊料微生物與季節因子的冗余分析Figure6 Redundancy analysis（RDA）of the relationship between bacterial phylum and the season parameters

2.5 發酵床微生物代謝相關基因的季節性差異

根據PICRUSt預測兩個季節主要有機物降解途徑，分析細菌群落對氨基酸、碳水化合物和脂類代謝的相關基因拷貝數的季節差異性。研究發現夏季高溫條件代謝相關基因豐度高，有機物代謝活躍（圖7）。夏季發酵床墊料細菌氨基酸、碳水化合物和脂類代謝基因的拷貝數分別為6808477、6480413和2121815，比冬季高27.3%、27.5%和27.1%。如，夏季墊料細菌群落中參與氨基酸代謝的氨基轉移酶、肽酶及脫羧酶的拷貝數分別為14 327、58 036和17 157，是冬季的1.5、1.3、1.6倍；糖酵解途徑中的葡萄糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶拷貝數是8048、28 506及4252，為冬季的1.8、1.1、1.3倍；脂類代謝中的羧酸酯酶和甘油磷酸二酯酶是16 860和44 061，為冬季的2.0、1.5倍。根據PICRUSt的預測信息，夏季發酵床細菌的有機物代謝基因數量高于冬季，推測夏季發酵床墊料細菌的代謝水平高于冬季，與細菌群落豐度和多樣性指數高有關。

圖7 發酵床細菌群落氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關基因的季節性差異Figure7 Functional prediction of bacterial community in amino acid，carbohydrate and lipid metabolism

3 討論

畜牧業產生的糞污及其副產物造成的環境污染是制約我國禽畜養殖健康發展的一大障礙。規模化養殖導致大量的糞便集中產生，未經處理排放至環境，會造成水源、土壤和空氣等嚴重污染[20-21]。采用微生物發酵的方式處理禽畜糞便，將養殖廢棄物轉化為生產有機肥，可實現資源充分利用。本研究分析了微生物發酵床夏季和冬季墊料的細菌多樣性，發現微生物發酵床的主要細菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。李志宇[22]采用傳統平板分離培養方法以及PCR-DGGE分子技術分析了發酵床墊料微生物的多樣性，發現主要的菌群為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。朱雙紅[23]采用16S rRNA克隆結合酶切分型的方式獲得生物發酵床樣本中的細菌組成，主要為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，這與本研究結果一致。采用宏基因組方法研究微生物發酵床中的細菌組成發現擬桿菌門占主要優勢，約為細菌總量的30%，而在李志宇[22]和朱雙紅[23]的研究中厚壁菌門是主要細菌，占細菌總量的55%以上。由于分子克隆方式通量不夠，不能全面揭示環境微生物多樣性，這是造成本研究結果與前人研究差異的主要原因，也說明宏基因組技術在環境微生物多樣性研究方面具有明顯優勢。微生物發酵床細菌群落多樣性分析結果表明微生物發酵床含有豐富的細菌資源，這為進一步挖掘新物種和新功能提供了重要來源。

夏季和冬季發酵床室溫有所差異，同時夏季和冬季發酵床墊料的細菌群落構成也不同。夏季優勢菌為特呂珀菌屬和漠河菌屬；冬季主要為假單胞菌屬和硫假單胞菌。特呂珀菌屬能夠適應高溫環境，最佳生長溫度為50℃，可利用多種糖類、有機酸和氨基酸[24]，在溫度較高的夏季（平均室溫為30.13℃）相對含量高。漠河桿菌屬于擬桿菌門黃桿菌科，分離于糞便發酵物[25]，參與糞便的生物降解。夏季高溫下，含量具有顯著差異的特呂珀菌屬和漠河桿菌屬參與高溫下的糞污降解。冬季發酵床中，假單胞菌屬和硫假單胞菌屬含量明顯高于夏季。假單胞菌分布廣泛，是重要的有機物降解菌[26-27]。分離自厭氧發酵的活性污泥中的硫假單胞菌是厭氧菌，可以硝酸鹽為電子受體氧化還原活性污泥中的硫化物，參與氮循環過程[28-29]。微生物發酵床中的假單胞菌屬和硫假單胞菌屬細菌可能與低溫下氮的利用相關。此外，在冬季的墊料樣本中，嗜冷菌屬和冬季微菌屬含量也高于夏季樣本。嗜冷菌屬是變形菌門莫拉氏菌科好寒或耐寒的細菌，常分布于潮濕、冷鹽的環境中，在溫暖和低鹽的環境中也有分布，在食品發酵中起重要作用[30]。冬季微菌屬是適冷性細菌，最適生長溫度為16～19℃[31]，在冬季發酵床平均室溫約為16℃，適合生長。冬季微生物發酵床適冷菌和嗜冷菌含量高，與冬季發酵床較低的溫度相關。綜上，溫度是影響發酵床墊料中細菌多樣性的重要因素之一。

微生物能夠通過有氧或厭氧發酵降解糞污中的有機物并產生能量[32]，目前已經有多種微生物和復合微生物菌劑應用于養殖廢棄物處理中。肖翰等[33]將微生物菌劑接種至發酵床墊料中，發現接種菌劑能夠顯著提高微生物數量、發酵溫度以及各種酶的活性。王義祥等[34]將復合EM菌劑添加至堆肥發酵系統，促進了有機質的礦化分解和提高腐殖化指數。復合微生物菌劑是一種多菌種共存的生物體系，每種微生物有各自特定的生活環境，許多微生物性能需在特定的環境中表達。因此，菌劑環境的適應性研究是復合微生物菌劑開發中的關鍵。墊料中的細菌包括能在較高溫度下起降解作用的嗜熱菌特呂珀菌屬、漠河桿菌屬、紫單胞菌科、間孢囊菌科及微球菌目的細菌，也包含低溫降解菌如假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、黃桿菌屬等。微生物發酵床中的這些細菌表現出對高溫和低溫環境的適應性，為降解養殖廢棄物復合微生物菌劑的研發提供基礎。

本研究揭示了夏、冬季節發酵床細菌的多樣性及其分布特征的差異性：夏季微生物發酵床中的放線菌和嗜熱菌等有機質降解菌含量高，促進夏季高溫條件下的豬糞降解；在冬季低溫條件下嗜冷菌和適冷菌含量高，促進豬糞在較低溫度下的降解。對夏、冬季節細菌多樣性的分析有助于研究細菌與環境的協同適應，發掘發酵床中蘊藏的耐熱、嗜冷和嗜鹽等嗜極細菌資源；同時為夏、冬季節發酵床的維護提供理論依據，促進以發酵床設施處理養殖廢棄物技術的發展。

4 結論

本研究揭示了夏、冬季節發酵床墊料細菌群落構成，優勢菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。夏、冬季節墊料細菌群落結構不同，前者有更為豐富的細菌類群。夏季樣本中的放線菌門和異常球菌-棲熱菌門的含量高于冬季樣本；異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌屬含量高于冬季樣本。冬季樣本中的擬桿菌門和變形菌門含量高于夏季樣本；擬桿菌門的嗜蛋白菌屬、冬季微菌屬和黃桿菌屬以及變形菌門的假單胞菌屬、硫假單胞菌屬和嗜冷菌屬含量高于夏季墊料。季節性溫度影響微生物發酵床細菌群落結構與代謝水平。

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