飛蝗幾丁質酶5-1抗體制備及表達特性分析

張婷婷，柳偉偉,2，高璐,2，李任建,2，付穗業,2，劉曉健，李大琪,3，劉衛敏，董卿,2，張建珍

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飛蝗幾丁質酶5-1抗體制備及表達特性分析

張婷婷1，柳偉偉1,2，高璐1,2，李任建1,2，付穗業1,2，劉曉健1，李大琪1,3，劉衛敏1，董卿1,2，張建珍1

（1山西大學應用生物學研究所，太原 030006；2山西大學生命科學學院，太原 030006；3山西省農業科學院植物保護研究所，太原 030031）

【目的】通過制備飛蝗（）幾丁質酶5-1（）的多克隆抗體，建立飛蝗體內LmCht5-1蛋白水平檢測方法，分析LmCht5-1在4齡飛蝗的表達特性及組織定位。【方法】采用MEGA 軟件對LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列進行比對，利用Expression網站對LmCht5-1氨基酸序列進行抗原表位預測分析，獲得LmCht5-1抗原結構區域；以飛蝗cDNA為模板，通過PCR擴增的抗原片段；同時通過酶切連接構建含有雞血清白蛋白OVA的載體pET32a-OVA；然后通過酶切連接將插入到pET32a-OVA載體構建pET32a-OVA-LmCht5-1；將pET32a-OVA-LmCht5-1轉入表達菌株BL21（DE3）中，IPTG誘導表達重組蛋白OVA-LmCht5-1；利用Ni-NTA純化后免疫新西蘭白兔，制備多克隆抗體。通過ELISA方法檢測抗體效價；利用Western blot檢測抗體特異性。提取4齡飛蝗不同日齡表皮，采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表達模式。對4齡飛蝗注射ds，檢測蛋白水平LmCht5-1表達量，并通過免疫組化方法對LmCht5-1進行定位及功能分析。【結果】通過和序列比對和抗原表位預測分析，獲得LmCht5-1的471—533AA可作為抗原區域；通過酶切連接分別獲得pET32a-OVA和pET32a-OVA-LmCht5-1。經誘導表達和純化后獲得重組蛋白OVA-LmCht5-1，分子量為71.34 kD；免疫后制備多克隆抗體OVA-LmCht5-1，ELISA檢測效價為1﹕102 400。多克隆抗體OVA-LmCht5-1用于Western blot檢測時可特異性識別LmCht5-1，與LmCht5-2蛋白無交叉反應。利用Western blot方法檢測4齡若蟲各日齡表皮中LmCht5-1蛋白的表達，發現LmCht5-1蛋白隨發育日齡其表達量逐漸增加，在蛻皮當天達到峰值，蛻皮后快速降至最低點。對飛蝗若蟲N4D2注射ds，檢測到在N4D5時，的轉錄水平和蛋白水平均被顯著抑制，抑制率分別為70.0%和73.6%。選取注射ds和ds的4齡飛蝗表皮，進行免疫組化實驗顯示LmCht5-1定位于表皮細胞和舊表皮中，其功能失活引起舊表皮中幾丁質不降解。【結論】獲得飛蝗LmCht5-1多克隆抗體可特異性識別LmCht5-1，可用于Western blot和免疫組化檢測。明確LmCht5-1在飛蝗4齡若蟲蛻皮當天表達最高，定位于表皮細胞和舊表皮中。ds可減少表皮細胞和舊表皮中LmCht5-1的表達，阻礙舊表皮中幾丁質的降解。

飛蝗；幾丁質酶5-1；抗體制備；表達分析；Western blot

0 引言

【研究意義】飛蝗（）是重要的世界性農業害蟲，其表皮周期性的生成與降解是重要的生物學現象，研究表皮發育對害蟲防治具有重要意義。【前人研究進展】飛蝗表皮富含幾丁質，其周期性的降解由幾丁質酶等催化完成。幾丁質酶5（chitinase5，Cht5）屬于Group I，是第一個被鑒定的昆蟲幾丁質酶基因（），由Kramer等[1]于1993年從煙草天蛾（）的蛻皮液中分離得到，之后該基因的直系同源基因在至少15個昆蟲物種中被陸續分離鑒定[2-5]，被認為參與昆蟲表皮幾丁質的降解[6-7]。Cht5在飛蝗中具有基因復制現象[8]，飛蝗Cht5包含和兩個基因，其中含有信號肽、幾丁質結合域和催化域，與已報道的昆蟲基因直系同源，通過向5齡若蟲注射ds，發現影響飛蝗5齡若蟲到成蟲期的蛻皮發育，造成飛蝗蛻皮困難而死亡；而抑制無可見異常表型。通過幾丁質結合蛋白Knickkopf（Knk）和Cht5蛋白在赤擬谷盜（）表皮的定位分析，發現Knk蛋白和Cht5蛋白共定位于新合成的表皮，提出Knk蛋白的新功能，即保護新合成幾丁質不被幾丁質酶降解[9]。YU等[10]通過幾丁質脫乙酰基酶2（CDA2）在飛蝗表皮的蛋白定位，發現該蛋白主要定位在外表皮（exocuticle）與上表皮（epicuticle）之間，結合生化和電鏡結果，發現了昆蟲CDA2的新功能，即連接外表皮和上表皮，具有支架作用，啟動幾丁質螺旋結構的形成和有序緊密排列。【本研究切入點】LmCht5-1的抗體缺乏，影響對其表達特性及功能的分析。制備高特異性LmCht5-1抗體，有利于解析其功能及與LmCht5-2的功能分化。【擬解決的關鍵問題】通過序列比對和抗原表位預測分析，獲得抗原結構區域，通過與高免疫原性雞卵清白蛋白偶聯制備高效多克隆抗體，檢測抗體效價與特異性，分析在飛蝗不同發育日齡的表達特性及組織定位；解析LmCht5-1蛋白缺失對表皮幾丁質降解的影響。為后續深入解析功能及其與的功能分化研究提供試驗材料和平臺條件。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在山西大學應用生物學研究所完成。

1.1 材料

試蟲：試驗用飛蝗飼養于山西大學應用生物學研究所昆蟲培養室。飼養條件：室溫28—30℃，光照14L﹕10D，相對濕度15%—25%。挑選大量3齡飛蝗若蟲進行同步化培養。取4齡各日齡飛蝗的表皮進行分析。

主要試劑：載體pET32a和JMB88-OVA為實驗室保存。IPTG、X-Gal購于索萊寶公司。蛋白純化Ni-NTA柱和RiboMAXTMExpression RNAi System購于Promega公司。Trizol、HiFi cDNA-script、SYBR Green、2×Tag Mix購自康為世紀，其他試劑均為分析純。

1.2 飛蝗LmCht5-1高免疫活性載體構建

1.2.2 pET32a-OVA-LmCht5-1構建 利用雙酶切方法從JMB88-OVA中酶切獲得OVA片段并插入至pET32a的對應酶切位點處，獲得pET32a-OVA載體。設計抗原序列的擴增引物（表1），酶切位點選用d III和I。以飛蝗表皮cDNA為模板，通過PCR方法，擴增抗原序列。利用d III和I同時雙酶切和pET32a-OVA，連接獲得pET32a-OVA-LmCht5-1。引物序列為d IIIF：gggATGGATGTCGAC TGCAGCGACG和I R：G AGGCTGTGCTTGGCCATGGAGC。

1.3 pET32a-OVA-LmCht5-1蛋白表達及純化

1.3.1 pET32a-OVA-LmCht5-1蛋白誘導表達 將載體pET32a-OVA-LmCht5-1通過42℃熱激的方法轉化至BL21（DE3）感受態中，在LB+Amp平板中進行篩選。挑取單克隆搖菌至OD600為0.6，加0.5 mmol·L-1IPTG于37℃誘導培養4 h。12 000 r/min離心1 min收集細菌沉淀，超聲波破碎后離心，分離上清與沉淀，通過12% SDS-PAGE電泳確定目的蛋白的表達部位。

1.3.2 蛋白OVA-LmCht5-1和OVA的Ni-NTA純化 將OVA-LmCht5-1菌液接種至400 mL LB培養基中，16℃過夜誘導。12 000 r/min離心1 min收集細菌沉淀，超聲波破碎后，12 000 r/min離心1 min收集包涵體。利用50 mmol·L-1Tris-HCl+200 mmol·L-1NaCl+8 mol·L-1尿素溶解包涵體后，使用Ni-NTA系統對溶解的包涵體蛋白進行純化。采用不同濃度咪唑進行逐級洗脫，并收集洗脫液餾分。利用12% SDS-PAGE蛋白膠檢測蛋白濃度和純度。收集蛋白純度較高的洗脫餾分，采用分子量為30 kD的超濾離心管（Millipore）對其進行超濾濃縮，12 000 r/min離心獲得超濾液。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用同樣條件對OVA蛋白進行表達與純化。

1.4 OVA-LmCht5-1抗體制備及效價檢測

1.4.1 OVA-LmCht5-1抗體制備方法 委托華大公司通過以下程序免疫新西蘭白兔以制備多克隆抗體，具體方法：取純化后的OVA-LmCht5-1蛋白400 μg，生理鹽水稀釋至500 μL，與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分混勻，制備油包水結構，對2.0 kg左右的新西蘭白兔的背部進行皮下注射，完成初次免疫。14 d與21 d分別進行一次加強免疫。在免疫之前通過耳靜脈取陰性血清用做后期蛋白特異性的檢測。28 d時，頸動脈取血收集全血，5 000 r/min離心10 min，2次離心后收取血清作為多克隆抗體血清[11]。

1.4.2 OVA-LmCht5-1效價檢測 采用ELISA方法測定所制備抗體的效價[12]。抗原包被為OVA-LmCht5-1抗原蛋白，終濃度為2 μg·mL-1，一抗為多抗血清，從200倍開始用PBS梯度稀釋，設置PBS為空白對照（Blank），以PBS稀釋的200倍陰性血清作為陰性對照（negative）；二抗為稀釋20 000倍的羊抗兔HRG，顯色后加50 μL終止液終止反應；雙波長（450/630 nm）測吸光值。抗體效價為1/2最大OD值所對應的稀釋倍數[13]。

1.5 OVA-LmCht5-1抗體特異性檢測

1.5.1 蛋白水平檢測OVA-LmCht5-1抗體特異性 取原核表達蛋白OVA-LmCht5-1和OVA檢測OVA-LmCht5-1抗體是否識別OVA；取筆者課題組利用昆蟲病毒表達系統獲得的真核蛋白[14]--acetylglucosaminidase（eLmNAG）、eukaryotic expression LmCht5-1（eLmCht5-1）和eukaryotic expression Cht5-2（eLmCht5-2），通過Western blot鑒定OVA-LmCht5-1抗體是否準確區分eLmCht5-1和eLmCht5-2；取飛蝗中腸與表皮蛋白樣品用于檢測OVA-LmCht5-1對組織樣品檢測的靈敏度和特異性。以上蛋白樣品濃度調整為500 ng·μL-1，上樣量均為30 μL，用于后續Western blot檢測。

1.5.2 Western blot檢測LmCht5-1 采用12% SDS-PAGE分離膠蛋白樣品，電泳條件為80 V 30 min，120 V 40 min。電泳結束后，采用濕轉方法將蛋白轉印至PVDF膜，濕轉條件為150 V，45 min。利用含10% BSA的TBS溶液在常溫下封閉1 h。TBST清洗3次，每次5 min。將OVA-LmCht5-1抗體稀釋2 000倍后進行孵育，時間為1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。二抗孵育羊抗兔IgG，時間為1 h，TBST洗滌5次，每次10 min。利用奧德賽雙紅外熒光捕捉信號并采集圖像。設置免疫前陰性血清為陰性對照，檢測抗體的特異性。

除了全要素生產率 （ln TFP）之外，本文參考以往研究還提出如下控制變量：企業規模 （ln size）、 企業年齡 （ln age）、資本密集度 （ln capints）、綜合稅率（taxrt）、 是否國企（equnat）、 有無外資（forcap）。具體變量定義見表1。

1.6 LmCht5-1在飛蝗不同發育日齡表皮中的表達特性

選擇4齡第1天（N4D1）至N4D5和N5D1的若蟲表皮，檢測不同發育日齡飛蝗表皮中蛋白的表達特性。以上所有樣品均取3個生物學重復，每個生物學重復3頭若蟲。分離飛蝗背部表皮，加入RIPA+PMSF+DTT混合液后子冰上進行勻漿，放置30 min后，離心取上清。采用BCA方法測定蛋白濃度，調整蛋白濃度為300 ng·μL-1。蛋白檢測參照1.5.2。利用灰度分析計算不同日齡表皮中LmCht5-1相對于-actin的表達量，觀察LmCht5-1表達量的變化以及對表皮發育的影響。

1.7 dsLmCht5-1的合成、注射與蛋白樣品制備

ds的合成與注射參照實驗室標準步驟進行[15-16]。選取4齡第2天飛蝗若蟲進行dsRNA注射，同時注射ds作為對照組。將dsRNA從飛蝗第2和3腹節連接處注入體腔，注射量為10 μg/頭，設置3個生物學重復，每個重復5頭若蟲。在注射后第5天取樣，分離飛蝗腹部背面表皮，方法參照1.6。

1.8 LmCht5-1在表皮中的組織定位及功能

取1.7中N4D4的表皮進行固定。按照標準石蠟切片制備方法制備飛蝗表皮切片[17]。利用OVA- LmCht5-1抗體染色確定LmCht5-1的表達定位。切片厚度為5 μm，每張載玻片上保留3—5張切片。將表皮石蠟切片進行抗原修復，雙氧水處理后，滴加1滴1﹕1 000稀釋的OVA-LmCht5-1抗體，室溫孵育2 h。洗滌后滴加1滴聚合物增強劑，室溫孵育20 min。再次洗滌滴加1滴羊抗兔HRP，室溫孵育30 min。PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次5 min。

利用Fluorescent Brightener 28（FB28）染色確定ds干擾對表皮幾丁質的影響。在上述石蠟切片中滴加1滴FB28，室溫孵育10 min，中性樹膠封固，晾干后熒光顯微鏡下觀察，以確定樣品中幾丁質的變化。

2 結果

2.1 飛蝗LmCht5-1高免疫活性載體構建

利用MEGA軟件將和氨基酸序列進行比對，發現的前445AA與序列一致度極高，此區域無法作為抗原制備抗體而區分和。在446AA后，與氨基酸序列一致度上較低（圖1-A），此區域與其他比對的相似度較低。利用軟件BepiPred Server 2.0分析發現，的471—533AA氨基酸序列富含抗原表位，可以作為制備的抗原序列。

利用ClonemanageV7軟件將與抗原序列進行虛擬偶聯后，通過TMHMM預測，發現該融合蛋白可溶性差。隨后通過酶切連接將JMB88- OVA中的OVA片段連接至原核表達載體pET32a中，構建pET32a-OVA骨架載體（圖1-B）；然后通過PCR擴增獲得抗原片段，通過酶切連接后插入至pET32a-OVA中，獲得可表達的高特異性抗原表達載體pET32a-OVA- LmCht5-1（圖1-C）。

2.2 OVA-LmCht5-1蛋白表達與純化

將構建好的pET32a-OVA和pET32a-OVA- LmCht5-1分別轉化BL21（DE3）感受態，挑取陽性克隆在LB+Amp培養基中過夜培養。隔日1﹕100接種，37℃培養4 h后，加0.5 mmol·L-1IPTG在16℃過夜誘導。收集菌液，超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，利用12% SDS-PAGE進行檢測。發現OVA蛋白在沉淀中表達，分子量為64.37 kD，OVA-LmCht5-1重組蛋白也在沉淀中表達，分子量為71.34 kD（圖2-A）。

按照上述培養條件將pET32a-OVA-LmCht5-1擴大培養至400 mL，破碎收集沉淀，用含8 mol·L-1尿素的緩沖液溶解包涵體后，利用Ni-NTA純化進行。蛋白上柱前PB中大量OVA-LmCht5-1，而結合緩沖液BB中蛋白量明顯減少，說明Ni柱對OVA-LmCht5-1有較強的結合能力。咪唑梯度洗脫后，在50—500 mmol·L-1的餾分中OVA-LmCht5-1量大，且條帶單一，雜蛋白含量少。收集50—500 mmol·L-1咪唑下的餾分，利用30 kD超濾離心管進行超濾濃縮。利用BCA測定總蛋白濃度為400 μg·mL-1，可用于制備多克隆抗體（圖2-B），同時純化OVA蛋白，通過Ni-NTA純化發現，OVA蛋白在100和200 mmol·L-1咪唑濃度下的餾分中條帶單一，收集在100和200 mmol·L-1咪唑濃度下的餾分，利用30 kD超濾離心管進行超濾濃縮，用于后續抗體特異性檢測與分析（圖2-C）。

A：LmCht5-1與LmCht5-2比對獲得特異性抗原序列LmCht5-1 specific antigen sequences through alignment with LmCht5-2；B：高免疫原性抗原通用載體pET32a-OVA Common high immunogenicity plasmid pET32a-OVA；C：OVA-LmCht5-1抗原表達載體Antigen expression plasmid pET32a-OVA

2.3 OVA-LmCht5-1 抗體制備及效價檢測

委托華大公司將OVA-LmCht5-1抗原與弗氏完全佐劑混合后注射新西蘭白兔，并進行兩次加強免疫。28 d后從頸動脈收集兔血液，通過離心收集到50 mL兔抗OVA-LmCht5-1血清抗體。在96孔酶標板中包被抗原蛋白OVA-LmCht5-1，利用ELISA方法檢測發現兔抗OVA-LmCht5-1抗體效價可達到1﹕102 400（表1），抗體產生效果良好，可用于后續Western blot和免疫組化檢測。

A：OVA和OVA-LmCht5-1原核表達The expression of OVA and OVA-LmCht5-1；B：抗原蛋白OVA-LmCht5-1純化The purification of OVA-LmCht5-1；C：OVA蛋白純化The purification of OVA。C：對照Control；S：上清Supernatant；P：沉淀precipitate；M：marker；PB：純化前蛋白Protein before purification；BB：結合緩沖液Binding buffer

表1 抗體效價檢測

Table 1 Detection of antibody titer

2.4 OVA-LmCht5-1 抗體特異性檢測

采用Western blot方法檢測OVA-LmCht5-1抗體的特異性。所選抗原蛋白為原核表達蛋白OVA- LmCht5-1和OVA、真核表達蛋白NAG、eCht5-1和eCht5-2[14]。抗體OVA-LmCht5-1與抗原蛋白OVA- LmCht5-1雜交產生條帶為71.34 kD，與OVA雜交顯示條帶為64.37 kD，說明抗體OVA-LmCht5-1能有效識別OVA-LmCht5-1和OVA的原核蛋白。抗體OVA-LmCht5-1與eLmNAG、eLmCht5-2雜交不顯示任何條帶，而可以在eLmCht5-1中識別分子量為57.0 kD的蛋白，說明該抗體有效識別LmCht5-1抗原，而不識別LmCht5-2抗原，實現對LmCht5-1和LmCht5-2的區分。提取飛蝗腸道MT和表皮CT的蛋白進行檢測，發現OVA-LmCht5-1可識別樣品中分子量為56.0 kD的蛋白，與預樣本中LmCht5-1蛋白大小一致，表明OVA-LmCht5-1抗體可用于檢測飛蝗表皮中LmCht5-1的表達（圖3-A）。同時將免疫前陰性血清識別上述抗原，未有任何條帶產生，說明新西蘭白兔自身血清中未含有識別LmCht5-1和OVA的抗體成分（圖3-B）。

2.5 飛蝗不同發育日齡表皮中LmCht5-1蛋白表達

提取飛蝗N4D1—N5D1中發育每天的飛蝗表皮蛋白，利用Western blot檢測發現，LmCht5-1隨著飛蝗日齡增加而表達量逐漸升高，在飛蝗蛻皮當天表達量達到最高。而在飛蝗蛻皮后的N5D1表達量快速降低，恢復到N4D1的起始水平（圖4）。

2.6 注射dsLmCht5-1對飛蝗LmCht5-1轉錄和蛋白水平表達的影響

在飛蝗N4D2注射ds和ds，在N4D5時提取飛蝗總RNA和表皮蛋白。RT-qPCR檢測顯示的轉錄本表達降低70%（圖5-A），蛋白水平檢測發現蛋白表達量減少73.6%，說明ds有效抑制在mRNA和蛋白水平的表達；同時說明OVA-LmCht5-1可特異性地識別飛蝗體內的LmCht5-1（圖5-B）。

A：OVA-LmCht5-1抗血清與不同蛋白雜交OVA-LmCht5-1 antibody hybridation with different kinds of antigen protein；B：陰性血清與不同蛋白雜交Negative antibody serum hybridation with different kinds of antigen protein。OVA-LmCht5-1：原核蛋白OVA-LmCht5-1 Prokaryotic expression protein OVA-LmCht5-1；OVA：原核蛋白OVA Prokaryotic expression protein OVA；eLmCht5-1：昆蟲真核表達系統表達LmCht5-1 Insect eukaryotic expression protein LmCht5-1；eLmCht5-2：昆蟲真核表達系統表達LmCht5-2 Insect eukaryotic expression protein LmCht5-2；eLmNAG：昆蟲真核表達系統表達LmNAG Insect eukaryotic expression protein LmNAG；MT：飛蝗中腸組織Midgut tissue of L. migratoria；CT：飛蝗表皮組織Cuticle tissue of L. migratoria

圖4 飛蝗不同發育日齡表皮中LmCht5-1蛋白表達

A：RNAi后mRNA水平檢測LmCht5-1表達mRNA level detection of LmCht5-1 by RT-qPCR；B：RNAi后蛋白水平檢測LmCht5-1表達Protein level detection of LmCht5-1 by Western blot

2.7 OVA-LmCht5-1檢測表皮中LmCht5-1定位及功能

取注射后發育至N4D4的飛蝗ds和ds的表皮樣品，制備石蠟切片，利用OVA-LmCht5-1抗體對其進行免疫組化檢測。OVA-LmCht5-1在注射ds的表皮樣本中無可見的信號，但OVA- LmCht5-1在注射ds的飛蝗表皮樣本中，可檢測到表達的強烈信號（圖6）。LmCht5-1蛋白在表皮細胞質和舊表皮中表達。ds組在N4D4時，舊表皮結構破壞，而同時期的ds組中表皮結構完整，表明LmCht5-1蛋白的作用方式為降解表皮中的幾丁質。

Cht5-1：幾丁質酶5-1 Chitinase 5-1；Epi：表皮細胞Epidermis cell；OC：舊表皮Old cuticle

3 討論

抗體制備是昆蟲基因功能研究的重要手段，然因昆蟲蛋白序列未知、功能域結構復雜、家族基因數量龐大而造成抗體制備困難[18]。筆者課題組曾通過多肽免疫制備幾丁質合成酶和幾丁質酶抗體，但均未獲得高效價的抗體，分析其原因為幾丁質酶蛋白免疫原性差。一般來說，提高抗原的免疫原性，是抗體制備成功的關鍵。雞卵清白蛋白OVA由386個氨基酸而組成，常作為蛋白添加劑用于提高生物藥或疫苗等的穩定性，同時OVA也可以通過半抗原偶聯而作為載體蛋白用于抗體制備[19-20]。在本研究中首先通過序列比對和抗原決定簇分析，獲取特異性的抗原序列。將與特異性抗原序列進行偶聯，通過原核表達與純化獲得大量的OVA-LmCht5-1抗原蛋白，用于制備多克隆抗體。

本研究中制備的OVA-LmCht5-1多克隆抗體利用ELISA進行效價檢測可達到1﹕102 400，足以滿足抗體使用需求。在抗體特異性方面，抗體OVA-LmCht5-1能有效識別體外真核表達的eLmCht5-1，識別分子量為57.0 kD的蛋白，而在eLmNAG和eLmCht5-2蛋白泳道中不產生雜交條帶，充分說明所制備抗體識別的特異性。此外，抗體OVA-LmCht5-1可以有效識別飛蝗表皮與中腸中的LmCht5-1蛋白。免疫前血清不能與蛋白OVA-LmCht5-1、OVA、NAG、eLmCht5-1、eLmCht5-2、飛蝗表皮和飛蝗中腸蛋白產生可見的雜交條帶，進一步表明，兔血清OVA-LmCht5-1是針對LmCht5-1的特異性抗體。OVA-LmCht5-1在ds注射組檢測到表達量極低的雜交條帶，而在對照組得到表達量較高的雜交條帶，不僅說明ds直接影響LmCht5-1在蛋白水平的表達，而且進一步證實抗體OVA-LmCht5-1特異性結合飛蝗表皮LmCht5-1蛋白。

4齡不同日齡的Western blot結果表明，LmCht5-1主要在第4和第5天表達，筆者課題組在mRNA水平研究表達時發現其在蛻皮前一天高表達[2]，而蛋白檢測則發現在蛻皮當天高表達，推測與mRNA和蛋白在表達上的時間差異有關。在蛻皮當天高表達，與其行使幾丁質降解、協助表皮蛻去的生理學功能相符合。進一步采用免疫組化技術鑒定LmCht5-1在飛蝗表皮組織中的表達位置和相對表達量，發現OVA- LmCht5-1抗體可特異性識別組織切片中LmCht5-1，主要在表皮細胞和舊表皮中表達，這與桑卷葉蛾和赤擬谷盜的研究結果一致[9,21]。而利用免疫前陰性血清對上述切片進行染色，未發現任何可見的信號，說明免疫前血清中不含有對表皮組織切片進行非特異結合的成分，進一步鑒定了OVA-LmCht5-1抗體的特異性。

飛蝗的表皮富含幾丁質，因此針對幾丁質的代謝途徑進行調控是防治害蟲的重要手段。昆蟲表皮發育關鍵基因功能的解析，有助于尋找新的靶標基因作為害蟲防治的靶點。筆者課題組已經利用RNAi技術發現幾丁質合成酶[16,22-27]和幾丁質酶[8,15,28]的缺失會引起飛蝗表皮形成與降解發生障礙而導致飛蝗死亡。飛蝗幾丁質酶5是催化飛蝗表皮降解的關鍵酶，且存在基因擴增現象，有2個亞型（和）[2]，與已報道的昆蟲基因直系同源，通過向5齡若蟲注射ds發現影響飛蝗5齡若蟲到成蟲期的蛻皮發育，造成飛蝗蛻皮困難而死亡；而-2是僅在飛蝗中發現的亞型，其若蟲期干擾后未發現明顯的表型變化。利用昆蟲桿狀病毒表達LmCht5-1和LmCht5-2進行體外酶活性測定時發現，LmCht5-1主要降解寡聚幾丁質，而LmCht5-2主要負責降解多聚幾丁質，二者的功能存在分化[29]。在飛蝗的胚胎發育過程中，和具有明顯的表達差異[8]，推測可能在飛蝗漿膜表皮降解和預若蟲表皮降解中發揮不同功能。進一步利用OVA-LmCht5-1抗體對蛋白進行時空表達定位，將有助于解析和在飛蝗胚胎發育及其他發育階段的功能分化。

4 結論

偶聯與抗原序列可獲得高免疫原性的原核蛋白OVA-LmCht5-1；通過該抗原所制備的LmCht5-1多克隆抗體可特異性識別飛蝗體內，可用于Western blot和免疫組化檢測。蛋白LmCht5-1在飛蝗4齡蛻皮當天表達量最高，定位于表皮細胞和舊表皮中。ds可抑制LmCht5-1蛋白表達，減少表皮細胞和舊表皮中LmCht5-1的表達，阻礙舊表皮中幾丁質的降解。

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（責任編輯 岳梅）

The antibody preparation and expression analysis of Chitinase 5-1 in

ZHANG TingTing1, LIU WeiWei1,2, GAO Lu1,2, LI RenJian1,2, FU SuiYe1,2, LIU XiaoJian1, LI DaQi1,3, LIU WeiMin1, DONG Qing1,2, ZHANG JianZhen1

(1Institute of applied biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of life science, Shanxi University, Taiyuan 030006;3Institute of plant protection, Shanxi academy of agricultural sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】The objective to this study is to prepare polyclonal antibody ofchitinase5-1 (LmCht5-1), establish method for detection ofprotein, understand the expression pattern of LmCht5-1 protein in the 4thinstar nymph and finally confirm its location and function.【Method】LmCht5-1 antigen structure area, which was selected by sequence alignment betweenandwith MEGA software and antigen epitope prediction analysis with the website of Expression, was amplified using cDNA ofas the template. The LmCht5-1 antigen sequence was cloned into expression vector pET32a-OVA, which contains ovalbumin to improve immunogenicity, to generate the antigen expression recombinant plasmid pET32a-OVA-LmCht5-1. pET32a-OVA-LmCht5-1 was then transformed intostrain BL21 (DE3). The IPTG induced OVA-LmCht5-1 was purified through Ni-NTA system and used as the antigen to generate polyclone antibody by rabbit immunization. The titer and specificity of OVA-LmCht5-1 were detected by ELISA and Western blot analysis, respectively. Then the expression pattern of LmCht5-1 in cuticle of the 4th instar nymph was analyzed in parallel by Western blot. Finally, the intracellular localization and function of LmCht5-1 in the 4thinstar nymph cuticle were detected by immunohistochemical analysis after the dsinjection. 【Result】The 5′ fragment (471-533AA) of LmCht5-1, which was selected as the antigen area with the sequence alignment between LmCht5-1 and LmCht5-2 and the epitope prediction analysis, was inserted into pET32a-OVA to obtain recombinant plasmid pET32a-OVA-LmCht5-1. The 71.34 kD recombinant protein OVA-LmCht5-1 was expressed, purified and immunized with rabbit to generate polyclone antibody. The titer of anti-serum of OVA-LmCht5-1 was 1﹕102 400 by ELISA detection. Antibody OVA-LmCht5-1 could accurately distinguish the LmCht5-1 but not LmCht5-2 in Western blot analysis. Further, it was found that the protein expression level of LmCht5-1 increasedgradually with the age in the 4th instar nymph ofand reached to the highest at the same day of molting, while it declined to the lowest after molting.Injection dsinto the 4th instar nymph led to the expression of LmCht5-1 significantly declined to 70.0% in mRNA level and 73.6% in protein level. The immunohistochemical analysis with the epidermis ofafter dsinjection, showed that LmCht5-1 was located in old cuticle and epidermis cell. Finally, it was found that the inhibition of protein expression of LmCht5-1 led to the chitin degradation blocking in old cuticle. 【Conclusion】High titer and specificity ofantibodies, which could be used for Western blot and immunohistochemistry analysis were obtained. The protein expression of LmCht5-1 reached to the highest level at the day of molting in 4th instar nymph. LmCht5-1 was located in the epidermis cell and old cuticle in the 4th instar nymph. Moreover, the injection of dstocould inhibit the protein expression of LmCht5-1 in epidermis cells and old cuticle, and finally caused the chitin degradation deficiency in old cuticle.

; LmCht5-1; polyclonal antibody preparation; expression pattern analysis; Western blot

2018-01-15；

2018-02-26

國家自然科學基金青年基金（31501905）、中國博士后科學基金（2016M591722）、山西省科技廳青年基金（201601D021120）

張婷婷，E-mail：zhangyanqiu3520@sxu.edu.cn。

張婷婷。通信作者張建珍，E-mail：zjz@sxu.edu.cn