異常血紅蛋白Hb New York的分子診斷及血液學特征分析

盧建 王繼成 姚翠澤 張艷霞 劉玲 駱明勇 秦丹卿

血紅蛋白病是一類由于血紅蛋白結構異常或者合成量不足引起的遺傳性疾病，該病主要分布在熱帶和亞熱帶地區,在我國多見于廣東、廣西和海南等南方地區[1]。血紅蛋白病可分為兩種：第一種是由α-或β-珠蛋白合成量不足引起的疾病稱為地中海貧血(簡稱地貧)；第二種是由珠蛋白的一級結構發生改變而引起的血紅蛋白的分子結構發生改變的疾病稱為異常血紅蛋白。我國80年代對全國20個省市進行了大規模血紅蛋白病的調查，顯示我國的南方為異常血紅蛋白高發區，其中Hb K是廣東省第二常見的β-珠蛋白鏈異常血紅蛋白病，僅次于Hb E[2]。Hb New York是由β-珠蛋白鏈上的點突變引起的異常血紅蛋白，在血紅蛋白電泳中多見于K組，是Hb K最常見的類型。Hb New York自1967年首次被發現是在紐約的一個祖籍廣東的華裔美國人的家庭中，隨后陸續在中國和東南亞也被發現并報道[3-5]。但對于Hb New York的臨床特征的分析，尤其是合并地貧時的血液學表現的報道還比較少。我們收集了34例基因診斷為Hb New York的病例并對其進行分析，報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2015年至2017年于廣東省婦幼保健院就診，血紅蛋白電泳顯示有Hb K且經基因檢測確診為Hb New York的34例患者。所有患者均為廣東籍居民，年齡為19～48歲，平均為29.7歲。取其外周血用于血常規和血紅蛋白電泳分析，提取外周血DNA用于珠蛋白基因檢測。

二、方 法

1.血液學分析

使用EDTA-K2采血管采集受檢者外周靜脈血，應用Sysm ex X S.1000i全自動血細胞分析儀(日本希森美康株式會社)完成包括紅細胞計數、血紅蛋白量及MCV、MCH等紅細胞指數的分析。采用全自動毛細管電泳儀(Capillar 2，法國Sebia公司)進行血紅蛋白的分析。以上實驗均按照儀器使用說明書操作。

2.常規珠蛋白基因診斷

應用廈門致善生物公司生產的磁珠法基因組DNA提取試劑盒和自動化儀器(Lab-Aid 820)提取所有病例的外周血基因組DNA。采用亞能生物技術有限公司(深圳)提供的α-和β-地貧基因檢測試劑盒(gap-PCR和PCR-RDB方法)對所有DNA標本進行地貧基因檢測。檢測范圍包括α-地貧3種常見缺失類型(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)和3種點突變類型(αQSα/、αCSα/、αWSα/)以及17種β-地貧的點突變。

3.β-珠蛋白基因測序

對β-珠蛋白基因(HBB)全長約2 kb分成3個片段進行引物設計和基因測序。PCR引物序列見表1。PCR擴增體系為30 μl：15 μl的Premix LA,10 pmol/μl的引物各2 μl,4 μl基因組DNA。PCR擴增反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，35個循環，72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物。將PCR擴增產物送上海英駿生物技術有限公司，使用美國ABI3100 DNA測序儀雙向測序。

表1 β-珠蛋白基因測序引物序列

結 果

一、異常血紅蛋白Hb New York患者血液學表型分析結果

34例患者中，25例單純的Hb New York雜合子病例的血液學表現差別不大，血紅蛋白電泳提示43.9%～52.0%的Hb K異常帶；1例為Hb New York合并β0-地貧，表現為明顯降低的紅細胞參數和升高的Hb K(91.8%)；8例為Hb New York合并α-地貧，其血液學也有不同的改變。詳細的血常規和血紅蛋白電泳結果見圖1、表2。

二、基因檢測結果

經常規地貧基因檢測方法(gap-PCR和PCR-RDB)的檢測，共發現5例基因型為--/αα，2例基因型為-α3.7/αα，1例基因型為αwsα/αα，以及一例β17/N。β-珠蛋白基因測序發現34例患者均檢測到HBB:c.341 T>A(CD113 GTG>GAG)雜合突變(見圖2A)。查詢血紅蛋白數據庫(http://globin.cse.psu.edu/)可知此突變為Hb New York。此外一病例還檢測到HBB:c.52 A>T(CD 17 AAG>TAG)雜合突變(見圖2B)，與以上地貧常規檢查方法檢測結果相符，為Hb New York合并β17地貧患者。

討 論

能引起珠蛋白功能改變的異常血紅蛋白包括地中海貧血樣變異、溶血性異常血紅蛋白和氧親和力異常性異常血紅蛋白病。這些異常血紅蛋白在單獨存在或復合地貧時，可表現為中間型或重型地貧[6]。目前常用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和sebia capillary方法進行血紅蛋白分析并發現特異性的異常血紅蛋白[7]。

圖1 Hb New York患者血紅蛋白電泳圖

A：單純Hb New York血紅蛋白電泳圖;B:Hb New York合并β17血紅蛋白電泳圖

表2 Hb New York的血液學特征

注：MCV紅細胞平均體積，MCH紅細胞平均血紅蛋白含量

圖2 Hb New York患者地貧基因檢測

A：HBB:c.341 T>A突變，即Hb New York；B：HBB:c.52 A>T突變，即β17/N

Hb New York一種血紅蛋白的變異體[β113(G15)Val → Glu， GTG>GAG]，β鏈113號位的纈氨酸位于螺旋G15位，處于β鏈分子內部，是疏水性氨基酸。被酸性氨基酸谷氨酸取代后，影響了分子內部的疏水性，所以Hb New York的穩定性不如Hb A，易于降解[8]。但由于α和β接觸面有3個氨基酸，接觸面比較廣，單個氨基酸變化可能不會對其穩定性帶來明顯的影響。所以該突變位點并沒有影響到血紅蛋白的生物學功能。通過對我們收集的病例進行血液學特征分析，單純Hb New York的雜合子是無明顯的臨床癥狀的，且血液學指標也正常，僅血紅蛋白電泳時會出現含量約50%的異常血紅蛋白，這與文獻報道的基本相同[9-10]，如果不進行基因測序，就可能就會被忽略。當Hb New York合并α-地貧時，除血紅蛋白電泳中較高比例的Hb K外，其他血液學指標與單純的α-地貧也是不同的。其中合并標準型(SEA)和靜止型(3.7、WS)的α-地貧也有不同的血液學表現。本文中一例Hb New York合并β0-地貧的患者，表現為輕度的小細胞低色素性貧血，這與Lee和Li等[11-12]的病例報道中無貧血的癥狀并不相同，這可能是由于本文的病例是孕婦，存在生理性貧血的可能。

雖然Hb New York沒有明顯的臨床表現，但其存在會干擾一些實驗室指標的測定，如糖化血紅蛋白、血小板計數等[13]。而且值得注意的是，由于Hb New York合并β-地貧的血紅蛋白電泳檢測到的Hb A比例大幅降低，容易引起誤診為重型β-地貧。在產前診斷中，這類Hb New York復合β-地貧胎兒也會因為父母親輕型的β-地貧表現，被很少關注或者忽略。因此對Hb New York及其合并其他地貧的臨床特征的認識有助于指導進一步的分子檢測和產前診斷，也可以為遺傳咨詢提供重要的參考價值。當然包括本文在內的文獻報道中，Hb New York合并其他地貧的病例還相對較少，今后我們將繼續收集更多的病例，以作更具有統計學意義的比較。

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