16S rDNA 克隆文庫法分析油藏細菌群落結構多樣性

萬真真

（安慶師范大學資源環境學院，安徽安慶246133）

大港油田擁有中國東部石油“小搖籃”的美譽，其地層結構復雜，長期采用水驅法開采，是典型的水驅“半開放”循環系統。經過40余年的水驅開采，部分油井石油含水率高達95%以上，這將導致石油開采成本加大[1]。如何實現包括高含水油藏、低滲透和稠油等低品位油氣資源的可持續開采已成為石油開采行業的瓶頸問題。微生物驅油技術的發展為解決貧油層或即將采空油層開采效率低的科學難題提供了可能。油藏微生物具有產表面活性劑、產氣和降解石蠟等功能，這些特性可降低原油粘度并增加原油流動性，有利于石油開采[2]。研究極端油藏環境的微生物群落結構，認識油藏微生物功能多樣性，有利于對油藏功能微生物群落進行系統調控。16S rDNA克隆文庫技術不僅能有效克服傳統微生物培養方法工作量大、耗時長、微生物信息量少等不足，而且突破了微生物培養技術的限制，能夠從基因水平上分析對象的微生物群落結構多樣性，具有廣泛的應用前景[3]。本文將運用16S rDNA克隆文庫技術對油田產出水中的微生物功能菌群多樣性進行系統分析，以期為貧油或枯竭油藏的微生物驅油技術的開發提供有參考價值的微生物學信息。

1 材料與方法

1.1 大港油田樣品中細菌總DNA提取

取石油產出水500 mL，用真空泵抽濾過濾膜；將濾膜用滅菌的剪刀剪碎，放入Lysing matrix E管（Fast DNA-Spinkit，MPBIO）中；然后加入978μL磷酸鹽緩沖液，并額外添加20μL PolyA（200μg Poly-adenylic acid），促進DNA與Lysing matrix E管中的濾膜結合，提高DNA提取率；再依次按照Fast DNA-Spinkit說明提取產出水總DNA；最后利用NanoDrop ND-1000（ThermoFisher，USA）檢測產出水中DNA含量。

1.2 16S rDNA基因PCR擴增

利用總DNA作為細菌16S rRNA克隆文庫構建的PCR擴增模板，選擇細菌16S rDNA序列通用引物對樣本進行PCR擴增。序列引物為：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’和 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應條件為95℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s和72℃延伸2 min，共35個循環，最后在72℃下延伸7 min。利用1.2%瓊脂糖凝膠檢測其擴增特異性，并利用瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒（Qiagen,Germany）對擴增的目標片段進行切膠回收。

1.3 16S rDNA基因文庫的構建

PCR產物經回收試劑盒純化后，將目標片段連接到pGEM-T easy vector(Promage公司)上，然后熱激轉化到大腸桿菌DH5α細胞中，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB平板上，37℃靜置培養16 h。隨機挑選100個白色單菌落，于100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，并送菌株測序。獲取序列后，利用Oligo和Mega5.0生物分析軟件剔除用于擴增的引物序列，并將所得序列輸入NCBI網站，利用Blast與GenBank中已有的16S rDNA序列進行比對分析，確定產出水中功能細菌群落結構特征。

2 結果與分析

通過與NCBI中登錄的細菌16S rDNA基因序列進行比對分析，發現大港油田石油產出水中的內源微生物組成主要如表1所示。

表1 油藏石油產出水細菌群落的16S rDNA序列比對分析結果

2.1 門水平上的菌群分布特征

通過克隆文庫分析獲得了油藏細菌的96個有效16S rDNA基因序列，由圖1可知，油藏石油產出水中細菌門類主要包括：α-變形桿菌門（Alphaproteobacteria）46%、β-變形桿菌門（Betaproteobacteria）35%、厚壁菌門（Firmicutes）8%、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）2%、互養菌門（Synergistia）1%、網團菌門（Dictyoglomia）1%、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）1%、γ-變形桿菌門（Gammaproteobacteria）1%以及未知菌門（unclassified Bacteria）。

圖1 油藏石油產出水細菌群落結構的16S rDNA克隆文庫分布（門水平）

2.2 屬水平上的菌群分布特征

油藏細菌克隆文庫分類結果顯示文庫所有菌屬都屬于細菌門，如圖2所示。其中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）占文庫比例高達42%；其次，代爾夫特菌屬（Delftia）占文庫比例為32%；而Caldicoprobacter及高溫脫硫弧菌屬（Thermodesulfovibrio）比例分別為4%和2%。本文通過細菌16S rDNA克隆文庫技術全面地揭示油藏環境微生物群落結構多樣性。

圖2 油藏細菌功能微生物在16S rDNA文庫的比例分布（屬水平）

2.3 油藏主要細菌的功能

2.3 .1 α-變形桿菌綱細菌功能

文庫分析揭示α-變形桿菌門（Alphaproteobacteria）是石油產出水中的第一大微生物門類，占文庫比例為45%。而通常情況下，絕大多數的α-變形桿菌門的細菌屬于寡營養型的微生物，即能在相對貧瘠的營養環境中生活。而油藏環境正是一種特殊的貧瘠生態環境，具有高溫、高壓、缺氧的地質特征，油藏環境中營養物質缺乏，其主要碳源通常情況下都是石油烴及其代謝衍生物。這種特殊的生態環境為α-變形桿菌門這類寡營養型微生物的大量存在創造了條件，使得其成為油田中的優勢菌。其中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是石油產出水中α-變形桿菌門的第一大種屬。研究發現鞘氨醇單胞菌耐受貧營養的代謝機制使其在自然界中有著極強的生命力和廣泛的分布[4]。Kumar等研究發現鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.GF2B對菲有較強的降解能力，而且表面活性劑鼠李糖脂還能顯著提高該細菌的菲降解效果[5]。Kilbane等研究指出Sphingomonas sp.GTIN11.A對多環芳烴9-氮-芴具有良好的降解效果，而且發現了該菌基因組涉及9-氮-芴降解的復合酶系由9-氮-芴末端雙加氧酶、2，3-二羥基聯苯雙加氧酶、復合物裂解酶、鐵氧化還原蛋白等主要功能酶蛋白構成[6]。也有文獻報到Sphingomonas sp.ZP1不僅可以降解菲、萘、甲苯等芳香族化合物，還能降解對甲醇、乙醇、水楊酸等醇類物質[7]。隸屬于α-變形桿菌門紅螺菌科的磁螺菌屬Magnetospirillum在石油產出水中也占有一定比例，該類微生物通常會產生磁小體，據報道磁小體具有類似于過氧化物酶活性的特征，能夠有效清除活性氧，有利于生命體適應于缺氧或微氧環境[8]。與此同時，還發現了如慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）等較稀有的菌屬。通過分析可知，油藏產出水中α-變形桿菌門的功能微生物以具有石油烴降解功能的鞘氨醇單胞菌屬為主，該類微生物可以利用石油烴類物質作為唯一碳源，通過降解長鏈烷烴或原油重質組分，改善極端環境下原油的流動性，在促進原油開采過程中具有重要的應用潛力。

2.3 .2 β-變形桿菌門細菌功能

β-變形桿菌門（Betaproteobacteria）作為石油產出水中第二大功能微生物門類，在該克隆文庫中的比例為37%。據文獻報道，Betaproteobacteria常常參與環境中多環芳烴類物質的代謝，同時，SIP分析方法也證明該類菌群在多環芳烴的生物降解方面具有較高的潛力[9]。產出水中的β-變形桿菌門主要由代爾夫特菌屬（Delftia）、青枯菌屬（Ralstonia）、以及叢毛單胞菌屬（Comamonas）組成。這里，代爾夫特菌屬占比達32%，而且該菌屬往往具有較強的降解石油類物質的潛力。其中，Delftia sp.是從化工行業廢水污染的河道水體中分離獲得的一株以2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）為唯一碳源和能源的原始菌株[10]，同時，Delftia sp.XYJ6則對苯胺有良好的降解效果[11]，另外，有報道顯示Delftia tsuruhatensis BM90菌種則具有降解多種酚類化合物的能力[12]。在該環境中也發現了β-變形桿菌門的Ralstonia，如Ralstonia eutropha在填料塔反應器中對高濃度的苯酚溶液（8.52 mol/m3）具有較高的降解效率[13]。Heidari等發現Ralstonia eutropha降解芳環類化合物雙酚A的動力學模型滿足Monod模型，其動力學參數Vmax=7.4(mg BPA g?1biomass h?1)及 Ks=10.8(mg/L)[14]。同時，也發現了叢毛單胞菌屬（Comamonas）的存在，該屬細菌大多能降解多種類固醇和多環芳香烴，例如Comamonas testosteroni中的β誘變-羥類固醇脫氫酶（誘變β-HSD）是誘導蛋白和激素降解的關鍵酶，能降解類固醇和多環芳香烴[15]，在石油類物質的降解中發揮一定作用。

2.3 .3 厚壁菌門細菌功能

Firmicutes厚壁菌綱，該類菌序列在樣品序列中所占比例為8%，為第三大類群，屬于厚壁菌綱的很多菌種是能夠產生芽孢的，這些芽孢能抵抗脫水和極端惡劣等環境。隸屬于厚壁菌門Firmicutes厭氧的Caldicoprobacter菌屬在石油產出水文庫中比例為4%，研究發現該菌屬能夠利用葡萄糖、乳糖和蔗糖等糖類進行發酵代謝，同時生成乙酸、乳酸、乙醇、CO2和H2等代謝產物，可以為其他微生物的代謝提供小分子的營養物[16]。與此同時，厚壁菌門中還發現了兼性厭氧梭菌Clostridia，熱厭氧單胞菌屬Thermanaeromonas以及穆爾氏菌Moorella等稀少的微生物，這些菌屬往往具有發酵糖類產乙醇、乙酸等小分子的能力。

2.3 .4 其他菌門細菌功能

在克隆文庫中2%屬于硝化螺旋菌門（Nitrospirae）中的兼性厭氧、嗜熱、脫硫的熱脫硫弧菌屬Thermodesulfovibrio。研究發現Thermodesulfovibrio aggregans能在55～60℃的高溫環境中生長，同時可以利用如氫、甲酸鹽、丙酮酸和乳酸等小分子作為電子供體，進行硫酸鹽還原代謝[17]。同時，熱袍菌目（unclassified Thermotogales）的微生物也存在。通常情況下，熱袍菌目細菌可以在90℃的極端高溫環境生長，所有的熱袍菌目的新陳代謝都是嚴格厭氧有機營養型的。而互養菌門Synergistetes厭氧菌Thermovirga為中等程度嗜熱的厭氧細菌，通常能夠利用蛋白質類、小分子氨基酸類以及部分有機酸類底物進行發酵代謝，但是不能夠利用糖類、脂肪酸和乙醇作為底物；與此同時往往會將胱氨酸和S等還原為硫化物[18]。另外，在文庫中發現了隸屬于脫鐵桿菌門Deferribacteres中的厭氧菌脫鐵桿菌Deferribacter，研究發現脫鐵桿菌屬細菌往往以分子氫、乙酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、丙酮酸鹽以及復雜的蛋白類化合物作為電子供體，而以Fe（III）、錳（IV）、硝酸或是元素硫作為電子受體進行生長代謝[19]。油藏環境中存在大量的耐高溫的兼性厭氧和嚴格厭氧的微生物，這些微生物通常存在降解小分子酸和醇類物質的潛力，為油藏利用本源微生物進行微生物驅油技術的發展提供了重要的分子生物學信息。

3 結論

利用細菌16S rDNA克隆文庫法對大港油田油藏內源微生物群落結構進行系統分析，發現油藏極端環境中仍存在大量的功能微生物，在細菌門類水平上包括Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Firmicutes、Nitrospirae、Synergistetes、Dictyoglomia、Deferribacteres以及 Gammaproteobacteria等菌門。油藏極端環境中存在大量涉及石油烴類物質降解的功能微生物，在此以Sphingomonas和Delftia菌屬為主。通過認識油藏極端環境微生物功能群結構特征，為微生物驅油技術的開展提供重要的參考信息。

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