石油污染長期脅迫下的土壤微生物代謝活性特征研究

胡 淳，

萬真真，劉海軍*，周葆華

(安慶師范大學資源環境學院，安徽安慶246133)

石油作為一種復雜的多組分碳氫類化合物，主要由飽和烴、芳香烴、樹脂和瀝青質等4類具有不同溶解性能的物質構成[1]。石油開采、加工、轉運、存儲、設備維修及偶然泄露等各個環節所導致的石油污染頻繁發生[2]。石油類污染物不僅可以在土壤介質中富集，還可以遷移到地下水、湖泊、濕地等環境中，而且很難從被污染的系統中清除，對自然生態系統和人類健康帶來巨大的威脅[3]。王金成等研究發現，石油烴污染不僅干擾了土壤氮、磷、鉀等營養元素的循環，而且影響土壤酶活性及微生物群落多樣性[4]。同時，甄麗莎等利用Biolog微平板技術發現石油污染土壤微生物群落Shannon、McIntosh和Simpson等指數與清潔土壤存在極顯著差異（P＜0.01）[5]。本課題組研究石油污染土壤（石油烴含量26.6 mg/g）的放線菌多樣性發現，石油污染土壤放線菌拷貝數為2.1×104copies/g，較清潔土壤低3個數量級[6]。與此同時，梁玉婷等利用基因芯片技術發現隨著石油污染程度的加劇，土壤總功能基因數量和多樣性呈明顯下降的趨勢[7]。

目前，用于檢測土壤微生物活性的主要方法有土壤酶活法、Biolog法、腺嘌呤核苷三磷酸ATP含量分析法、耗氧速率分析法等[8]，以上方法往往存在工作量大、操作復雜等不足。分子生物學技術的發展讓我們從基因和分子水平上對復雜的土壤微生物代謝能力具有了全新的認識[7,9,11]。然而，分子生物學技術成本高的特點限制了該技術的廣泛使用。微量量熱法是基于能量代謝的一種新興的能夠原位實時在線和無損傷的研究生物熱力學和生物動力學的生物學方法，具有靈敏度高（納瓦級熱功率）、高自動化操作和信息量大的優點[10]，而且該方法還可以滿足不同層次和結構水平研究對象的需求，依次包括簡單的生物分子、單純的細胞器、特異的細胞、組織和生物個體和復雜的生態系統[11]。作為一種能夠有效評價微生物代謝活性的高靈敏度技術，微量量熱技術在環境微生物學、生物化學、環境科學和生態學等領域具有廣泛的應用前景。然而，微量量熱法在石油污染長期脅迫下的土壤微生物代謝活性方面的研究比較匱乏。基于此，本文結合FDA酶活分析法和微量量熱法對油田土壤的石油污染狀況進行了詳細分析，以期為石油污染土壤的生態風險評估和生物修復提供重要的基礎信息和理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集與處理

采樣地區為大港油田某區塊內以注水井（S1和S2）和采油井（S3、S4、S5、S6、S7和S8）為中心，直徑20 m以內區域。采用隨機布點法對樣品進行采集，取樣時，去除表層土壤，采取表層下10～20 cm土層土壤，并裝入無菌塑料袋封存，每個區間采樣3次，并合并作為1個樣本。將土壤樣本自然風干并過1 mm篩子，一部分用作石油烴含量檢測和基本理化參數分析，一部分用作微量量熱分析和FDA酶活性分析。所有土壤樣本于實驗室條件下，置于4℃恒溫保存。

1.2 土壤理化特征分析

利用超聲-紫外法測定石油污染土壤石油烴含量（Oil）；利用重鉻酸鉀氧化法檢測樣本的有機質含量（Organic matter，OM）；利用pH計檢測樣本酸堿度（土水比為1∶5）；利用重量法檢測土壤樣本含水率（Water）；利用凱氏定氮法測定土壤樣本總氮含量（Total nitrogen，TN）并利用1N NaOH擴散法測定土壤樣本有效氮含量（Nitrogen，N）；同時，利用碳酸氫鈉浸提法測定土壤樣本速效磷含量（Phosphorus,P）。

1.3 土壤FDA酶活性分析

用熒光素鈉配制20 μg/mL熒光素標準溶液，并繪制490 nm處光密度與熒光素濃度的標準曲線。分別稱取5 g過2 mm篩的新鮮土壤和150℃干熱滅菌的土壤（對照）于三角瓶中。依次添加15 mLpH 7.6磷酸二氫鉀緩沖液和0.2 mL1 000 μg/mL熒光素二乙酸（FDA）溶液，密封并置于30℃、200 r/min條件下振蕩培養20 min；然后立即加入15 mL氯仿/甲醇溶液終止反應，以2 000 r/min轉速離心2 min，并取上清液于490 nm處比色測定。

1.4 土壤微生物能量代謝分析

利用微量量熱分析儀TAMIII（TA，USA）檢測石油污染土壤的微生物代謝活性熱功率曲線。具體過程：在安瓿管中分別添加1 g新鮮石油污染土壤和0.4 mL營養液（1.5 mg葡萄糖和1.5 mg硫酸銨），密封并置于培養溫度維持在28℃的量熱檢測系統中，實時在線檢測土壤樣本的熱功率隨時間變化的數據，獲得土壤樣本熱動率曲線。土壤微生物總放熱量（Qtotal/J）由熱功率曲線進行面積積分求得，而微生物生長速率（k/min-1）由下式求得：

其中t為微生物代謝熱的在線檢測時間，Pt為檢測時間為t時對應的熱功率，P0為微生物生長對數期的起始熱功率。最大熱功率（Pmax/μW）和到達最大熱功率的時間（T/h）可以由熱功率曲線直接讀取[12]。

1.5 數據分析

利用IBM SPSS Statistics 22對土壤理化參數和生物熱力學參數進行Pearson相關性分析，利用OriginPro 8軟件繪制石油污染土壤的微生物代謝熱功率曲線圖，并利用Excel 2003繪制生物熱力學參數（Pmax,Qtotal,T和k）和土壤FDA酶活性隨石油污染程度變化直方圖。同時，利用Canoco 4.5軟件進行RDA冗余分析，以揭示石油污染土壤環境因子對采用位點分布的貢獻率及石油污染對土壤微生物代謝活性的影響。

2 結果與分析

2.1 石油污染土壤基本狀況

土壤中石油烴類污染物含量能夠用來揭示土壤石油污染的程度。大港油田某區塊注水井和產出井周邊石油土壤理化狀況如表1所示。注水井S1-S2周邊土壤石油烴含量為0～4.1 mg/g，平均值為2.1 mg/g。而產出井S3-S8周邊土壤石油烴含量范圍為12.3至86.6 mg/g，同時，平均值高達47.47 mg/g。通過分析發現產出井周邊的土壤石油烴含量明顯高于注水井周邊土壤的。Saterbak等研究發現，土壤石油烴濃度超過10 mg/g時，會明顯抑制土壤蚯蚓生存和種子萌發[13]。同時，產出井周邊土壤有機質含量均值為104.9 mg·g-1，遠遠高于注水井周邊土壤的（均值7.4 mg·g-1）。結合表1中土壤理化性質分析可以發現，石油烴污染不僅能改變土壤N、P等元素的空間分布，而且能夠明顯影響土壤有機質組成，嚴重干擾了土壤微生態。因此，系統研究石油污染土壤微生物代謝活性對污染土壤的風險評估和生態修復具有重要的意義。

2.2 土壤FDA酶活性檢測

作為土壤環境微生物學基本指標之一，FDA酶活性能夠有效揭示土壤微生物活性及其環境微生物所棲息微生態的客觀變化[14]。邢奕等研究鐵礦區微生物活性特征發現土壤重金屬污染程度加劇能夠促使土壤FDA酶活性下降[15]；王光飛等研究發現外源低劑量生物炭可以提高土壤FDA酶活性，而高劑量的輸入反而會抑制土壤FDA酶活性[16]。目前對于石油污染土壤中FDA酶活性的報道較少，本文利用FDA酶活性檢測客觀評價石油污染對土壤微生物能量代謝的干擾。圖1反映了石油污染長期脅迫下油田土壤FDA酶活性分布特征。其中，注水井S1-S2周邊土壤FDA酶活性范圍為37.54～67.59 μg/g，均值高達56.41 μg/g；而產出井S3-S8周邊土壤FDA酶活性分布范圍為 6.16～32.13 μg/g，其均值僅有 21.40 μg/g，結果表明較高濃度石油污染會明顯抑制土壤FDA酶活性，意味著石油污染嚴重干擾了土壤微生物的能量代謝過程。該結論與文獻報道結論相一致，環境外源物質石油、重金屬和生物炭等會影響土壤介質微生物代謝活性，FDA酶活性作為基本的環境微生物學指標之一，可以用來定量分析石油污染對土壤生態的影響。

表1 石油污染土壤石油烴含量及基本理化特征分析

圖1 不同石油污染程度下的土壤FDA酶活性比較

2.3 土壤微生物能量代謝特征

土壤微生物熱功率曲線揭示了石油污染土壤內源微生物群落在營養液激活下的能量代謝特征，如圖2所示。每組功率-時間曲線（n=3）均表現出良好的重現性，客觀有效地體現了每組土壤樣本中微生物能量代謝的差異；而且每組曲線均具有比較完整的停滯期、指數生長期、穩定期和衰亡期等，與常規的微生物培養的各生長階段能較好吻合，意味著微量量熱法能夠從能量代謝角度指示復雜環境下微生物的新陳代謝規律；與此同時，在長期石油污染脅迫強度不同的情況下，各組熱功率曲線存在明顯差異。由圖3可得，注水井S1和S2周邊土壤的最大熱功率Pmax分別高達511.49 μW和468.70 μW；而石油采出井（Oil＞36.2 mg/g）周邊土壤Pmax明顯降低，其范圍為141.74 μW至209.11 μW；對所有樣本的Pmax與石油污染程度進行擬合分析可以發現兩者之間呈負相關性（曲線斜率-162.32，R2=0.62）。而對于土壤微生物總放熱量而言，未被石油污染土壤S1樣本Qtotal值為17.26 J，而輕度污染S2樣本Qtotal值高達30.40 J；但是，當土壤石油含量高于12.3 mg/g時，總放熱量整體呈下降趨勢（-6.64，R2=0.27）。就到達對應的最大熱功率Pmax所需時間T而言，注水井土壤樣本時間最短，分別為820.00 min和1 061.17 min，而石油污染土壤S7所需最長時間為2 141.67 min；與此同時，時間T與石油污染程度擬合結果揭示兩者之間呈正相關關系（508.40，R2=0.76），表明石油污染會抑制土壤微生物的生長代謝過程。分析發現未被石油污染的注水井S1土壤樣本的微生物生長速率k值最大，達0.005 1 min-1，而石油污染最為嚴重的產出井S8土壤的生長速率最低，僅為0.002 2 min-1；生長速率k與石油污染程度擬合結果表明兩者之間呈負相關關系（-0.0010，R2=0.78），表明石油污染對土壤微生物的生長過程具有抑制作用，干擾了土壤微生物正常的物質代謝。

圖2 不同石油污染程度下的土壤微生物熱功率曲線

圖3 土壤微生物熱動力學參數變化特征

通過對石油污染土壤的微生物代謝熱功率參數 Pmax、Qtotal、T 和 k綜合分析發現，Pmax、Qtotal和生長速率k與土壤石油污染程度存在負相關性，而時間T與其呈正相關性。該結果表明長期石油污染脅迫對土壤內源微生物的代謝活性影響較大，也意味著石油污染對土壤微生物群落結構造成了明顯影響。由土壤總放熱量變化規律Qtotal(S1)＜Qtotal(S2)，Qtotal(S2)＞Qtotal(S3-8)推測，石油污染土壤中應該存在有效降解石油烴的微生物，在輕度石油污染脅迫下，該部分具有降解功能的微生物在營養液的激活下可同時利用營養液和石油烴類進行物質代謝，從而實現自身繁殖并釋放較多熱量；然而，在較高石油污染濃度脅迫下，絕大部分微生物的代謝活性受到抑制，也包括具有降解功能的微生物。綜合結果表明，土壤微生物能量代謝和微生物多樣性研究方法在揭示石油污染對土壤內源微生物的環境行為干擾方面具有相似性。周勇等結合微量量熱法和顯微觀察法研究了重金屬鋅對土壤典型真菌的影響，發現在Zn濃度為160～1 920 μg/g的土壤中微生物可以生存，并具有典型的熱功率-時間曲線；而高濃度土壤（6 000 μg/g）的熱功率-時間曲線僅為直線（Pmax≈0 μW），同時顯微觀察表明示蹤真菌已經消失[16]。微量量熱法作為一種靈敏的、實時在線的監測能量代謝的有效手段，在環境污染、監測和修復等方面具有廣泛應用前景[17]。

2.4 土壤理化特性對能量代謝的影響

石油污染土壤理化參數與生物熱力學參數的Pearson相關性分析如表2所示。

表2 石油污染土壤理化參數與生物熱力學參數的Pearson相關性分析

由表2可知，石油污染土壤理化參數及內源微生物熱力學參數Pearson相關性分析表明，長期石油污染干擾了土壤系統碳、氮和磷等營養元素循環。首先，石油污染土壤有機質OM含量范圍為47.9～198.3 mg/g，明顯高于正常土壤值；而且，污染土壤OM與石油濃度之間呈顯著正相關關系（r=0.980，P＜0.01）。當油污土壤有機質含量高于85 mg/g時，石油類物質對其含量的貢獻高達50%。土壤有機質作為與土壤肥力密切相關的環境因子，是土壤肥力的潛在表現，然而石油污染導致的土壤OM升高并不能有效釋放營養以供環境生物生長，甚至對生命體造成毒性[8,23]。其次，對于營養元素氮而言，通過分析發現長期石油污染對土壤總氮（r=-0.186，P=0.631）和有效氮（r=-0.643，P=0.062）空間分布的影響并不明顯，該結果與相關文獻報道比較吻合[5]。同時，Pearson相關性分析揭示石油污染程度與土壤有效磷P之間存在明顯的正相關性（r=-0.860，P＜0.01）。長期石油污染脅迫不僅干擾了土壤的營養元素循環，而且影響了土壤的水土保持能力。高濃度石油污染土壤的含水率減少到新鮮土壤的一半左右，同時，相關性表明土壤石油濃度與含水率之間呈顯著的負相關性（r=-0.925，P＜0.01）。土壤含水率減少，不僅會影響土壤結構，也會嚴重干擾氧氣和營養元素在土壤空隙中的遷移和轉化。

土壤石油濃度與微生物能量代謝過程密切，石油濃度分別與Pmax（r=-0.749，P＜0.05），Qtotal（r=-0.804，P＜0.01）和k（r=-0.835，P＜0.01）呈負相關關系，而與T呈正相關關系（r=0.794，P＜0.05）。土壤水含量與微生物的代謝活性之間也表現出密切的關系，含水率與Pmax（r=0.818，P＜0.01）和k（r=0.819，P＜0.01）呈顯著正相關性，與Qtotal呈正相關性（r=0.729，P＜0.05）；而與T呈負相關性（r=-0.797，P＜0.05），相關性揭示了水對土壤微生物代謝活動具有重要意義。而且，有效氮N與T呈顯著負相關性（r=-0.805，P＜0.01），與k（r=0.771，P＜0.05）呈正相關性，表明有效氮在一定程度上能夠加快石油污染內源微生物的能量代謝過程。速效磷P具有與有效氮N相似的結論，其不僅與Pmax（r=0.883，P＜0.01）和k（r=0.825，P＜0.01）呈顯著正相關，同時與時間T呈顯著負相關性（r=-0.805，P＜0.01），意味著速效磷對土壤微生物的能量代謝過程具有重要的激活作用。結合石油污染土壤的環境因子與微生物能量代謝的RDA冗余分析（如圖4所示）發現高濃度的石油污染不僅改變了土壤結構，也抑制了土壤微生物能量代謝過程，而且其中含水率、速效磷和有效氮等環境因子在激活土壤微生物能量代謝過程中表現出了積極作用；總氮和土壤酸堿度對土壤微生物的代謝活性影響較小。研究環境因子與微生物能量代謝之間的關系對后續的土壤生物修復具有重要的意義。

圖4 石油污染土壤環境因子與內源微生物能量代謝的RDA冗余分析

3 結論

綜上所述，利用土壤FDA酶活力和微量量熱技術共同分析石油污染對土壤微生物代謝活性的影響，結果表明，高濃度石油污染明顯抑制了土壤FDA酶活性，改變了土壤微生物典型的熱功率曲線；FDA酶活力和量熱法在揭示石油污染對土壤微生物能量代謝過程中具有一致性。Pearson相關性和RDA冗余分析揭示土壤較高石油含量與微生物代謝活性呈負相關性，而土壤含水率、速效磷和有效氮等環境因子與其呈正相關性。該研究為石油污染土壤的微生物修復提供了有價值的參考信息。

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