低強度脈沖超聲和吡格列酮對脂多糖誘導的OA軟骨細胞IGF-1/mTOR/PGE2通路的影響

張婷婷，李雪萍

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種以關節軟骨基質、滑膜以及關節周圍組織退變為特征，涉及生化、機械和遺傳因素的復雜作用疾病[1-2]。不僅包括細胞分解代謝反應的增加，如II型膠原和I型膠原的凈分解代謝，以及細胞外基質合成反應的減少，從而使軟骨關節面出現纖維化，形成基質裂縫和垂直裂隙[3]。低強度脈沖式超聲(Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)作為一種局部機械刺激，可增加軟骨細胞的遷移率和增殖率、外基質蛋白多糖的合成以及促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化，具有軟骨保護作用[4-5]。吡格列酮是臨床上較為常用的降糖藥物，可以調節細胞內脂質代謝、能量平衡、炎癥反應等[6]。近年來研究發現吡格列酮可以激活細胞過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptors γ, PPARγ)，上調自噬相關蛋白(autophagy-related proteins,Agt)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)等表達，促進自噬活動，減少炎性因子的累積，起到軟骨保護作用[7-8]。研究表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、多種白細胞介素(interleukin，IL)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在體內外中被認為是軟骨組織中較為常見的促炎性細胞因子[9]，這些刺激物通過刺激軟骨細胞生成基質蛋白酶及其他炎癥產物加速OA病理生理進展過程。因此，本研究通過胰島素生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)/前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)途徑探討吡格列酮和LIPUS對LPS誘導的OA軟骨細胞的作用比較。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗細胞:所有軟骨標本均取自健康新西蘭大白兔膝關節。②試劑與設備:胰蛋白酶、高糖完全DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)培養基、II型膠原(Type Ⅱ Collagen,COL2)抗體(中國 武漢博士生物工程有限公司)、mTOR抗體、GAPDH抗體(Abcam公司)、實時聚合酶鏈式反應(realtimepolymerase chain reaction,RT-PCR)相關試劑(美國Invitrogen公司)、細胞活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8) 、IGF-1、PGE2酶聯免疫吸附測定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(中國 南京建成生物工程研究所)、免疫化學染色試劑盒(中國 福州邁新生物科技有限公司)、全蛋白提取試劑盒、LPS、吡格列酮(美國sigma公司)、Western電泳儀、濕式電轉移槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法 ①軟骨細胞的分離和培養：取24只體質量約為2.0～3.0kg的健康成年雄性新西蘭大白兔，從膝軟骨標本表面完好部分提取正常軟骨細胞。將膝軟骨標本用PBS液沖洗3次并切碎至1.0mm3的小碎片，移入15ml離心管，加入2ml 0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫箱中消化30min，移去胰蛋白酶液，加入3ml 0.25% II型膠原酶和3ml完全高糖DMEM培養基(含10%的胎牛血清)，靜置于37℃恒溫箱中過夜。次日，取出上清，離心10min(轉速1200r/min)，棄上清，加入完全高糖DMEM培養基吹打均勻后將細胞種植于培養瓶中，置于37℃恒溫箱中。每天用光學顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞鋪滿瓶底90%左右時傳代[4]。②實驗分組：選取最佳吡格列酮干預濃度：用1uM,10uM,50uM,100uM不同濃度的吡格列酮分別干預LPS誘導的OA軟骨細胞，應用CCK-8檢測技術，測定各組軟骨細胞的增殖能力，選取增殖能力最強的吡格列酮干預濃度，用于下一步研究。實驗分為4組，每組6只，正常組、LPS組、LIPUS組(LPS+LIPUS)、吡格列酮組(LPS+100uM吡格列酮,Pioglitazone組)4組,LIPUS組和Pioglitazone組干預前4h給予LPS預處理,劑量同LPS組(2ug/ml)。③LIPUS及吡格列酮干預軟骨細胞：將LIPUS探頭涂抹耦合劑后置于培養瓶底部，自由模式，通斷比20%，頻率為3MHz，強度為40mW/cm2,每次照射20min,1次/d,共7d[10-11]。吡格列酮干預的細胞在含有100uM吡格列酮培養基中連續培養7天，每2天更換一次含有100uM吡格列酮的培養基。④LPS誘導OA軟骨細胞方法[12-13]。本研究使用含2ug/ml LPS加入培養基中培養軟骨細胞4h建立OA模型。

1.3 檢測指標 ①CCK-8檢測增值率：取各組軟骨細胞進行消化、計數，配制細胞懸液1.2×105個/ml， 96孔細胞培養板中每孔加入100μl細胞懸液。根據CCK-8試劑盒說明書進行增殖率測定。②ELISA檢測IGF-1和PGE2的濃度：取各組軟骨細胞培養上清液，分別根據ELISA試劑盒說明書進行濃度測定。③免疫化學染色法測定COL2表達：每張爬片滴加2滴3% H2O2-甲醇溶液,室溫封閉10min。滴加即用型山羊血清,室溫孵育20min。滴加COL2抗體(1∶100稀釋)50～100ul,室溫孵育2h，PBS浸洗3次。滴加增強劑,室溫濕盒孵育30min。PBS浸洗3次。滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50ul,室溫孵育30min。PBS浸洗3次。每張片子加2滴新鮮配制的二氨基聯苯胺溶液。自來水沖洗,將切片放入蘇木素染液,染色10min,蒸餾水沖洗，用二甲苯浸泡10min。晾干后在切片上加中性樹膠,加蓋玻片。光學顯微鏡下觀察軟骨細胞中COL2的表達情況,拍照保存。④免疫蛋白印跡法測定mTOR含量：提取細胞蛋白：取出長滿軟骨細胞的培養皿，去除培養液，用PBS洗一遍，在培養皿中加入1ml的裂解液，充分晃動均勻，使裂解液和細胞充分接觸。在冰上裂解20min后用細胞刮將細胞刮下，將細胞移入EP管，放入4℃離心機，15min，12000轉。取上清至新的EP管，加入5xSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液?；旌虾螅湃?00℃，加熱15min。用于下一步聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式電泳槽轉膜,聚偏二氟乙烯膜在5%的封閉液中常溫震蕩封閉2h，分別加mTOR抗體、GAPDH抗體(1∶1000),4℃孵育過夜,緩沖液洗膜3次，加二抗，常溫孵育2h,緩沖液洗膜3次，顯影液顯影,機器曝光。⑤RT-PCR測定mTOR含量。按照PCR試劑盒說明書進行軟骨細胞的mTOR，GAPDH的RT-PCR檢測。GAPDH作為內參基因。利用 2-ΔΔCT法進行分析軟骨細胞mTOR基因表達。引物信息見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1 正常組與模型組軟骨細胞比較與鑒定 免疫細胞化學染色示正常軟骨細胞COL2染色均成陽性,細胞胞漿內有棕黃色顆粒,胞核基本無著色(圖1A)。LPS組LPS誘導的軟骨細胞COL2呈弱陽性,細胞胞漿內顆粒少且淡黃,胞核基本無著色(圖1B)。

2.2 CCK-8證實吡格列酮促進軟骨細胞增殖 與正常組相比，1uM組軟骨細胞增殖活力無明顯變化，10uM組，50uM組，100uM組軟骨細胞增殖活力較強(均P<0.05)。其中，100uM組軟骨細胞增殖活力較10uM、50uM組強(均P<0.05)(圖2A)。因此，本研究選取100uM吡格列酮與LIPUS進行研究對比。

圖1A正常組軟骨細胞COL2染色形態學表現(×400)

圖1BLPS組軟骨細胞COL2染色形態學表現(×400)

(軟骨細胞核用黑色箭頭表示,細胞內外所表達的COL2染色陽性用紅色箭頭表示)

2.3 ELISA證實吡格列酮和LIPUS對LPS誘導的OA軟骨細胞IGF-1、PGE2的表達作用 干預后，與正常組相比,LPS組的IGF-1表達水平明顯降低(P<0.05)，而LIPUS組的IGF-1表達水平明顯上升(P<0.05)，而Pioglitazone組無明顯變化。與LPS組相比,Pioglitazone組和LIPUS組的軟骨細胞IGF-1表達水平均上升(均P<0.05)。與LIPUS組相比，Pioglitazone組IGF-1水平明顯下降(P<0.05)(圖2B)。與正常組對比,其余各組PGE2均升高,但僅LPS組和LIPUS組差異有統計學意義(均P<0.05)。與LPS組相比,LIPUS組和Pioglitazone組的軟骨細胞PGE2表達水平明顯下降(均P<0.05)；與LIPUS組相比，Pioglitazone組PGE2明顯下降(P<0.05)(圖2C)。

2.4 RT-PCR和Western blot證實LIPUS、吡格列酮對LPS誘導的OA軟骨細胞mTOR的作用 干預后，與正常組對比,LPS組和LIPUS組軟骨細胞mTOR mRNA水平和蛋白含量均升高(均P<0.05)，Pioglitazone組的軟骨細胞mTOR mRNA水平和蛋白含量降低(均P<0.05)；與LPS組相比,LIPUS組和Pioglitazone組的軟骨細胞mTOR mRNA水平和蛋白含量明顯下降(均P<0.05)；與LIPUS組相比，Pioglitazone組mTOR mRNA水平和蛋白含量明顯下降(均P<0.05)(表2，圖3，圖4)。

組別nmTOR 正常組60．37±0．05 LPS組60．82±0．10a LIPUS組60．66±0．05ab Pioglitazone組60．22±0．02abc

與正常組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05；與LIPUS組比較，cP<0.05

圖2 各組軟骨細胞增殖活力以及IGF1、PGE2表達水平

(*表示與正常組比較，P<0.05,#表示與LPS組比較，P<0.05,+表示與Pioglitazone組比較，P<0.05)

圖3RT-PCR檢測各組軟骨細胞mTOR的mRNA表達水平比較

(所有數據均以GAPDH為參數)

圖4Western blot檢測各組軟骨細胞mTOR蛋白含量比較

(所有數據均以GAPDH為參數)

3 討論

本研究結果顯示，LIPUS可以增加LPS誘導的OA軟骨細胞IGF-1的表達增高，且作用較吡格列酮強。IGF-1作為軟骨細胞的合成性細胞因子，是各種生長因子中第一個被確認對關節軟骨中有分泌調節作用的細胞因子，發揮合成代謝作用，在促進細胞的生存、生長和代謝中起著至關重要的作用，其分泌減少與OA的發生發展密切相關[14-15]。IGF-1在軟骨組織工程研究中起到相當重要的角色，主要與抑制軟骨細胞內多個信號通路，如：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)/ 蛋白激酶(Akt)/mTOR和Ras/Raf-1/ERK信號通路，通過有絲分裂、抗凋亡作用和刺激軟骨細胞外基質的合成有關[16-17]。Li等[18]用3D技術培養體外軟骨細胞證明IGF-1可以促進COL2的表達，并且認為≤100ng/ml的IGF-1可以促進關節軟骨細胞增殖，呈劑量依賴性。Ikeda等[19]將IGF-1基因轉染到人滑膜間充質干細胞，發現其成軟骨能力、增殖能力均明顯增強，并且呈現出高營養和成骨特性，極大的促進了對受損軟骨細胞的修復作用。研究者用吡格列酮治療30例胰島素抵抗的多囊卵巢綜合征患者后發現血清IGF-1水平顯著增加，這可能與直接或間接改善胰島素敏感性有關[20]。而關于LPIUS對軟骨細胞IGF-1的影響研究甚少，LIPUS可以上調骨髓來源的ST2細胞的骨鈣蛋白和IGF-1， 并刺激ST2細胞的向軟骨細胞分化[21]。Tang等[22]利用超聲微泡轉染IGF-1cDNA至軟骨細胞提高大鼠跟腱損傷愈合速度。

本研究結果顯示，LIPUS可以降低LPS誘導的OA軟骨細胞PGE2的表達增高，但吡格列酮作用較LIPUS強。PGE2被認為是骨關節炎的促炎癥細胞因子和分解代謝介質，可以促進基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的合成，抑制COL2和蛋白多糖的生成，從而改變軟骨基質修復和降解的平衡狀態，加重關節退化和臨床癥狀[23]。王濤等[24]使用聚焦超聲單次治療慢性軟組織30min后出現受損組織的PGE2含量降低，提示超聲可以較快緩解組織炎癥。而在成骨細胞中，LIPUS可以導致PGE2的釋放增加以及環氧合酶的表達上調[25]。Chen等[26]用高糖誘導人軟骨細胞PGE2，IL-6，MMP-13高表達，但這些被吡格列酮所逆轉，且呈劑量依賴性。

mTOR是一種存在于哺乳動物中的Ser/Thr激酶，阻斷各種對軟骨細胞的生長刺激信號，負性調控軟骨細胞的生長代謝，參與OA的病理學進展[27-28]。超聲治療可以選擇性抑制巨噬細胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號通路起到抑制炎癥、抗凋亡、抗脂質聚集作用[29]。而吡格列酮通過PPARα和PPARγ依賴性自噬途徑增加細胞脂肪分解，β-氧化和自噬減輕肝臟脂肪變性[30]。本研究結果顯示，LIPUS和吡格列酮分別可以減少LPS誘導的OA軟骨細胞mTOR的表達。因此，我們猜測LIPUS和吡格列酮可能通過抑制IGF-1/ mTOR/PGE2信號途徑減輕軟骨細胞炎癥反應，促進受損軟骨組織修復，阻斷關節軟骨退變或骨關節炎的發生[31]。

綜上所述，LIPUS和吡格列酮可能通過IGF-1/mTOR/PGE2信號通路上調LPS誘導的OA軟骨細胞IGF-1的表達，同時抑制PGE2表達，起到OA軟骨細胞保護作用。LIPUS促進LPS誘導的OA軟骨細胞IGF-1的表達作用較吡格列酮強，而吡格列酮抑制PGE2的表達作用較LIPUS強。

[1] Benito MJ, Veale DJ, FitzGerald O, et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2005,64(9):1263-1267.

[2] Goldring MB, Goldring SR. Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. Ann N Y Acad Sci, 2010,119(2): 230-237.

[3] Antoniou J, Steffen T, Nelson F, et al. The human lumbar intervertebral disc: evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration[J]. J Clin Invest, 1996,98(4):996-1003.

[4] 夏鵬, 李雪萍, 林強, 等. 低強度脈沖超聲對兔膝骨性關節炎軟骨細胞整合素-局部粘著斑激酶-促分裂原活化蛋白激酶力化學轉導通路相關蛋白表達的影響[J]. 中華物理醫學與康復雜志, 2014,36(3):165-170.

[5] Uddin SM, Richbourgh B, Ding Y, et al. Chondro-protective effects of low intensity pulsed ultrasound[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2016,24(11):1989-1998.

[6] Li Y, Zhang Y, Chen C, et al. Establishment of a rabbit model to study the influence of advanced glycation end products accumulation on osteoarthritis and the protective effect of pioglitazone[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2016,24(2):307-314.

[7] Hsiao PJ, Chiou HC, Jiang HJ, et al. Pioglitazone Enhances Cytosolic Lipolysis, beta-oxidation and Autophagy to Ameliorate Hepatic Steatosis[J]. Sci Rep, 2017,7(1):9030-9037.

[8] Cheng NT, Meng H, Ma LF, et al. Role of autophagy in the progression of osteoarthritis: The autophagy inhibitor, 3-methyladenine, aggravates the severity of experimental osteoarthritis[J]. Int J Mol Med, 2017,39(5):1224-1232.

[9] Nguyen QT, Jacobsen TD, Chahine NO. Effects of Inflammation on Multiscale Biomechanical Properties of Cartilaginous Cells and Tissues[J]. ACS Biomater Sci Eng, 2017,3(11):2644-2656.

[10] Cheng K, Xia P, Lin Q, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on integrin-FAK-PI3K/Akt mechanochemical transduction in rabbit osteoarthritis chondrocytes[J]. Ultrasound Med Biol, 2014,40(7):1609-1618.

[11] 瞿燕萍, 程凱, 林強. 低強度脈沖超聲經整合素-FAK-p38 MAPK通路對膝關節脂肪墊共培養下軟骨細胞的影響[J]. 中華物理醫學與康復雜志,2017,39( 4 ): 241-246.

[12] Campo GM, Avenoso A, Campo S, et al. Molecular size hyaluronan differently modulates toll-like receptor-4 in LPS-induced inflammation in mouse chondrocytes[J]. Biochimie, 2010,92(2):204-215.

[13] Campo GM, Avenoso A, Campo S, et al. Purified human plasma glycosaminoglycans reduced NF-kappaB activation, pro-inflammatory cytokine production and apoptosis in LPS-treated chondrocytes[J]. Innate Immun, 2008,14(4):233-246.

[14] Tuncel M, Halici M, Canoz O, et al. Role of insulin like growth factor-I in repair response in immature cartilage[J]. Knee, 2005,12(2):113-119.

[15] Blunk T, Sieminski AL, Gooch KJ, et al. Differential effects of growth factors on tissue-engineered cartilage[J]. Tissue Eng, 2002,8(1):73-84.

[16] 任莎莎, 李雪萍, 林強, 等. 低強度脈沖超聲經 PI3K/Akt 通路調控兔膝骨性關節炎軟骨細胞凋亡的作用機制研究[J]. 中國康復, 2015,30(2):83-87.

[17] Cailotto F, Bianchi A, Sebillaud S, et al. Inorganic pyrophosphate generation by transforming growth factor-beta-1 is mainly dependent on ANK induction by Ras/Raf-1/extracellular signal-regulated kinase pathways in chondrocytes[J]. Arthritis Res Ther, 2007,9(6):122-129.

[18] Li Y, Fan Q, Jiang Y, et al. Effects of insulin-like growth factor 1 and basic fibroblast growth factor on the morphology and proliferation of chondrocytes embedded in Matrigel in a microfluidic platform[J]. Exp Ther Med, 2017,14(3):2657-2663.

[19] Ikeda Y, Sakaue M, Chijimatsu R. IGF-1 Gene Transfer to Human Synovial MSCs Promotes Their Chondrogenic Differentiation Potential without Induction of the Hypertrophic Phenotype[J]. 2017,20(7)::58041-58047.

[20] Glintborg D, Stoving RK, Hagen C, et al. Pioglitazone treatment increases spontaneous growth hormone (GH) secretion and stimulated GH levels in polycystic ovary syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90(10):5605-5612.

[21] Naruse K, Mikuni-Takagaki Y, Azuma Y, et al. Anabolic response of mouse bone-marrow-derived stromal cell clone ST2 cells to low-intensity pulsed ultrasound[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000,268(1):216-220.

[22] Tang Y, Leng Q, Xiang X, et al. Use of ultrasound-targeted microbubble destruction to transfect IGF-1 cDNA to enhance the regeneration of rat wounded Achilles tendon in vivo[J]. Gene Ther, 2015,22(8):610-618.

[23] Koch B, Baum W, Burmester GR, et al. [Prostaglandin E2, interleukin 1 and gamma interferon production of mononuclear cells of patients with inflammatory and degenerative joint diseases][J]. Z Rheumatol, 1989,48(4):194-199.

[24] 王濤, 蘇靜, 陳文直, 等. 聚焦超聲單次治療慢性軟組織損傷兔局部肌組織前列腺素E2、pH值以及血漿β-內啡肽的變化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2008,12(13):2451-2454.

[25] Kokubu T, Matsui N, Fujioka H, et al. Low intensity pulsed ultrasound exposure increases prostaglandin E2 production via the induction of cyclooxygenase-2 mRNA in mouse osteoblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999,256(2):284-287.

[26] Chen YJ, Chan DC, Lan KC, et al. PPARgamma is involved in the hyperglycemia-induced inflammatory responses and collagen degradation in human chondrocytes and diabetic mouse cartilages[J]. J Orthop Res, 2015,33(3):373-381.

[27] Carames B, Taniguchi N, Otsuki S, et al. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J]. Arthritis Rheum, 2010,62(3):791-801.

[28] 王浩, 曹飛, 斯海波, 等. 雷帕霉素調控自噬在骨關節炎軟骨細胞退變中的機制研究[J]. 中華骨與關節外科雜志, 2017,10(3):248-253.

[29] 王和峰, 翟純剛, 龐文會, 等. PI3K/Akt/mTOR信號通路在巨噬細胞自噬及動脈粥樣硬化斑塊不穩定中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013,29(3):390-397.

[30] Zheng L, Li Y, Li X, et al. Combination of Hydroxyl Acetylated Curcumin and Ultrasound Induces Macrophage Autophagy with Anti-Apoptotic and Anti-Lipid Aggregation Effects[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,39(5):1746-1760.

[31] Ouyang J, Jiang H, Fang H, et al. Isoimperatorin ameliorates osteoarthritis by downregulating the mammalian target of rapamycin C1 signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2017,16(6):9636-9644.