生存素對淀粉樣前體蛋白代謝的調節作用

蔣偉青，袁欣，劉晨，任瀟，王永剛

（1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 神經內科，上海 200127；2.鄭州大學第一附屬醫院 神經內科，河南 鄭州 450052）

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD）病理學特點表現為腦內淀粉樣斑塊和神經原纖維纏結[1]。淀粉樣斑塊由β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積所形成，而Aβ由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經過蛋白水解作用而產生，APP代謝異常會導致Aβ的產生和清除失衡而導致Aβ過度沉積[2-3]。凋亡參與許多神經退行性疾病如AD的神經元死亡過程[4]。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的重要成員之一，在抑制凋亡和調控細胞分裂中起重要作用[4]。本研究探討survivin對APP代謝的調節作用。

1 材料和方法

1.1 材料 原代大鼠海馬神經元、PC12細胞購自上海賽傲公司。survivin抗體、APP抗體及GAPDH內參抗體購自英國Abcam公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光技術：細胞爬片用PBS浸洗后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗后，0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗后用山羊血清室溫封閉30 min，4 ℃孵育一抗過夜，PBST浸洗后，室溫避光孵育熒光二抗，PBST浸洗后，封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2 質粒轉染：轉染前1 d，將細胞接種到6孔板。次日，吸盡培養基，用Opti-MEM培養基洗滌細胞2次。對于每孔細胞，用200 μL Opti-MEM培養基分別稀釋空載體1 μg、HA-APP質粒1 μg、HAAPP質粒和GFP-survivin質粒[5]各1 μg，混勻放置10 min后將Lipofectamine 2000與質粒混合，混勻后室溫放置25 min，加入到6孔板的細胞中推勻，將培養板放入37 ℃孵育，轉染48 h后進行蛋白提取或凋亡染料染色。

1.2.3 Western blot：利用CockTail/RIPA（1∶100）裂解細胞提取總蛋白，測定蛋白濃度后定量加樣進行SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜后用5% BSA于室溫慢搖封閉2 h，TBST洗滌后，4 ℃搖孵育一抗（5% BSA稀釋）過夜，TBST洗滌后，室溫慢搖孵育HRP二抗（5%BSA稀釋）2 h，TBST洗滌后進行壓片顯影。

1.2.4 流式細胞儀檢測：凋亡染色利用細胞凋亡檢測試劑盒，PI和Annexin V染色后進行流式細胞儀分析，利用CellQuest軟件對結果進行分析、繪制散點圖。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0進行統計學分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色結果 通過免疫熒光染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，發現在體外原代培養的大鼠海馬神經元內survivin與APP可以共存。這一結果提供了survivin在神經系統內調節APP代謝的形態學證據（見圖1）。

圖1 大鼠海馬神經元survivin與APP免疫熒光染色結果（×63）

2.2 Western blot檢測結果 將構建好的HA-APP質粒分別單轉染或者與GFP-survivin質粒共轉染具有神經元反應性的PC12細胞，轉染48 h后，裂解細胞，通過Western blot檢測APP在PC12細胞內的表達。結果顯示，APP和survivin共轉染組與APP單轉染組比，APP表達量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。這表明survivin可以抑制APP在PC12細胞內的表達。

2.3 流式細胞儀檢測結果 將APP單轉染與APP和survivin共轉染PC12細胞用凋亡染料PI和Annexin V染色后，經流式細胞儀檢測發現，APP單轉染后出現了大量的細胞凋亡，APP和survivin共轉染后凋亡率明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖3。表明APP過量表達可以誘發細胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細胞凋亡。

3 討論

本研究發現，體外原代培養的大鼠海馬神經元內survivin與APP可以共存，survivin可以抑制APP在PC12細胞內的表達，APP過量表達可以誘發細胞凋亡，survivin可以抑制APP所引起的細胞凋亡。

凋亡是許多神經退行性疾病中神經元死亡過程的重要參與因素[4]。雖然一些臨床和亞臨床的研究已經報道IAP的神經保護作用，但是它們的臨床益處尚不清楚。Survivin在胚胎組織及有細胞增殖的組織均有表達[6-7]，且在炎癥組織[8]、創傷性腦損傷[9-10]和腫瘤組織[11-13]中有過表達。通過操縱survivin來抑制凋亡和調控有絲分裂從而達到神經元的保護作用，因此可在神經修復和保護中得以利用。細胞實驗已證明survivin基因（桿狀病毒IAP重復序列）突變體對分化后神經細胞具有促進分裂和增殖的作用[14]，另有動物研究報道，在腦損傷后，survivin參與調節成年小鼠海馬DG區神經前體細胞活性并抑制神經元凋亡或程序性死亡[15]。另外，已有不同survivin突變體用于腫瘤治療的研究[16]，借鑒類似的方法，有助于開拓對神經退行性

疾病治療的新思路。

圖2 Survivin抑制APP在PC12細胞內的表達

圖3 Survivin抑制APP誘導的PC12細胞凋亡

APP是APP家族蛋白成員之一，不同的酶促作用使其產生具有不同生理作用的衍生物。APP參與引起癡呆的最常見的退行性疾病，即AD的病理生理過程。另外，有報導發現唐氏綜合征的患者中APP表達升高。因此，研究參與調控APP代謝的機制對相關疾病的治療研究具有一定價值[17]。目前關于AD的病理生理解釋包括膽堿能假說、Aβ假說、tau蛋白假說和免疫假說[18]。其中主流的Aβ假說認為，APP代謝異常會導致Aβ的產生和清除失衡而導致Aβ過度沉積[2-3]。目前臨床上對于AD的治療策略包括乙酰膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑[19]，對于AD治療策略的研究方向主要以Aβ和tau蛋白為靶點[18，20]。雖然目前尚未有利用survivin達到AD治療效果的報導，但是，最近的一項研究發現，予轉基因AD小鼠亞硒酸鈉飲食，可上調Wnt/β-catenin信號通路并反式激活包括survivin在內的基因表達，同時可減少APP磷酸化從而減少APP裂解和Aβ形成[21]，表明survivin在調節APP代謝中的潛在作用。本研究發現，survivin可以抑制APP在細胞內的表達，同時survivin可以抑制APP過表達所引起的細胞凋亡。本研究結果對未來suivivin參與AD治療方面的研究提供了一定理論基礎。

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