缺血性腦卒中患者血漿microRNA-23a/30a水平變化及其臨床意義

賀文濤 耿紀超

隨著經濟的發展、人民生活水平的提高以及人口老齡化的到來，缺血性腦卒中(腦梗死)的發病率呈逐年上升趨勢。缺血性腦卒中具有較高復發率、致殘率、病死率的特點，積極探討其發病機制對防治腦卒中具有重要的臨床意義。有研究顯示，microRNA(miRNA)在腦血管疾病的發生與發展中發揮著重要的作用[1]。人體內的miRNA至少調控著30%的人類基因，miRNA不僅參與人體正常生理功能的調節，而且與多種病理過程密切相關[2-3]。本研究選取miRNA-23a/30a水平進行檢測，初步探討其在缺血性腦卒中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院神經內科自2014年7月-2015月7月收治的40例缺血性腦卒中患者作為研究對象，所有患者均在48 h內入院，其中男25例，女15例；年齡42～79歲，平均年齡(63.3±4.6)歲；發病至就診時間(1.36±0.52)d；合并糖尿病6例，高血壓病5例，高脂血癥4例，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)4例。根據入院時臨床神經功能缺損評分標準[4](中國)，將入選患者分為輕型組(<30分)和重型組(≥30分)。其中輕型組20例，男12例，女8例，年齡41～77歲，平均年齡(63.3±4.6)歲，發病至就診時間(1.36±0.52)d，合并糖尿病5例，高血壓病4例，高脂血癥3例，冠心病6例；重型組20例，男13例，女7例，年齡42～78歲，平均年齡(64.6±5.1)歲，發病至就診時間(1.42±0.42)d，合并糖尿病4例，高血壓病5例，高脂血癥2例，冠心病5例。2組患者的性別、年齡、發病至就診時間、合并癥等指標比較無明顯差異(P>0.05)。并同期選取20例性別、年齡相匹配的體檢健康者作為對照組。所有入選患者均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準(1995年)；排除標準：①合并有腦出血者，既往有腦卒中病史者；②近期內有創傷手術史者；③心肺肝腎功能不全者；④伴有惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫性疾病者，本研究遵守《赫爾辛基宣言》，并通過本院醫學倫理委員會批準。本研究的目的、方法、可能后果向患者及家屬交待清楚，并簽署書面知情同意書。

1.2 2組miRNA的相對表達水平檢測

血漿miRNA樣本的收集：分別采集輕型組、重型組和對照組外周血5 mL，3000 r/min，4℃ 離心10 min，取上層血漿移至1.5 mL離心管(eppendorf tubes，EP)中，-80℃冰箱保存。血漿總RNA的提取：標本解凍后進行兩相分離，通常RNA分布于上層無色水相中；取上層液進行RNA沉淀，管底出現白色沉淀，將獲得的白色沉淀進行洗滌和溶解， DU800型分光光度計測定RNA的濃度及純度；隨即進行逆轉錄反應，將獲得的逆轉錄產物保存于-20℃的冰箱中。實時定量熒光聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，Real-time qPCR)技術檢測microRNA-23a/30a的水平，Real-time qPCR引物合成由英濰捷基(上海)貿易有限公司提供，PCR引物序列：miRNA-30a和miRNA-23a分別為5’-ATGGTTCGTGGGTGTAAACATCCTCG-3’；5’-AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3’，內參照基因為U6 RNA。嚴格按照 Access RT-PCR System 試劑盒說明書進行操作。由計算機上的SDS軟件計算每個樣品和內參的Ct值，△Ct=Ct目標基因-Ct內參基因，缺血性腦卒中患者與對照組miRNA的相對表達水平用公式計算=2-(Ct目標基因-Ct內參基因)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 輕型組、重型組和對照組血漿miRNA-23a/30a水平的比較

入院時輕型組與重型組血漿miRNA-23a/30a水平分別與對照組比較，重型組明顯高于對照組(P<0.05)，而輕型組與對照組比較無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 輕型組、重型組和對照組血漿miRNA-23a/30a水平的比較)

注：與輕型組、對照組比較，*P<0.05

2.2 輕型組和重型組治療前后血漿miRNA-23a/30a水平的比較

輕型組和重型組不同時間點的血漿miRNA-23a/30a水平進行比較，2組患者在入院1周時血漿水平達到高峰(P<0.05)，其后逐步下降，重型組患者維持在較高水平(表2)。

2.3 治療1周后血漿miRNA-23a/30a水平與病情嚴重程度的相關性分析

治療1周后血漿miRNA-23a/30a水平與病情嚴重程度進行Spearman秩相關的非參數分析顯示，血漿miRNA-23a/30a水平與病情嚴重程度呈正相關(r=0.917,P<0.05)(圖1)。

表2 輕型組和重型組治療前后血漿miRNA-23a/30a水平的比較)

注：與同組入院時、入院2周比較，*P<0.05；與輕型組比較，△P<0.05

圖1 血漿miRNA-23a/30a水平與病情嚴重程度的相關性分析

3 討 論

腦卒中(腦血管意外)是在一系列誘發因素作用下引起的腦血液循環功能障礙，分出血性和缺血性腦卒中兩大類，其中以缺血性腦卒中為主，腦卒中預后較差，致殘率、復發率、致死率較高。缺血性腦卒中具有復雜的病理生理過程，受遺傳、環境、基因等多種因素相互作用，是多種機制共同作用的結果，包括能量障礙、細胞酸中毒、氧自由基損傷、一氧化氮NO等多種因素作用，在高血壓、高血糖、高血脂及動脈粥樣硬化等基礎上經過腦血管內皮細胞受損、血小板粘附聚集、血管內膜增殖等一系列的復雜演變過程最終導致血栓形成[5-6]。盡管針對腦卒中危險因素進行積極干預，但腦卒中的發病率并未呈下降趨勢。隨著分子生物學和生物信息學技術的發展，人們逐步認識到一些不可干預因素如表觀遺傳調控在腦血管疾病的發生與發展中扮演重要角色。在表觀遺傳學中DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變。有研究顯示，miRNA是表觀遺傳調控機制中最重要的組成部分之一[7]。

miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，由21～23個核苷酸組成，1個miRNA可以調節幾個不同的mRNA，不同的miRNA可以調節同1個mRNA，因此其在基因遺傳調控中的機制極其復雜。迄今為止，miRNA已發現了100多個，目前大量的基礎實驗研究普遍認為這些小分子RNA可能是1個龐大的miRNA家族，并不是簡單的破碎產物，其在不同疾病、不同水平上可能發揮著重要作用[8]。盡管如此，有很多方面仍不明了。目前，miRNA-23a/30a在缺血性腦卒中的研究未見相關報道，本研究根據相關文獻報道[9]選取miRNA-23a/30a水平進行檢測，初步探討其在缺血性腦卒中的作用。已知miRNA-23a定位于19號染色體(19p13.13)上，主要在轉錄水平調控基因的表達[10-11]，miRNA-30a是miR30家族中一員，有研究顯示miRNA-30a通過靶向調節線粒體分裂來調節細胞凋亡，其在自噬調節中發揮重要作用[12-13]，但其在心腦血管疾病方面的研究較少。

本研究結果顯示，重型組入院時血漿中miRNA-23a/30a水平明顯高于對照組，提示重型腦卒中患者血漿中miRNA-23a/30a水平呈高表達，兩者在治療后1周達到最高水平，且重癥組血漿中miRNA-23a/30a水平明顯高于輕型組，提示病情越重，二者的水平越高。本研究結果還顯示，血漿microRNA-23a/30a水平與病情嚴重程度呈正相關(r=0.917,P<0.05)，提示兩者可能共同參與了缺血性腦卒中的發生發展。這與相關研究結果[14-15]一致。

綜上所述，外周血miRNA-23a/30a表達水平與缺血性腦卒中關系密切，隨著miRNA與缺血性腦卒中關系研究的不斷深入，進行外周血miRNA-23a/30a水平測定有望成為缺血性腦卒中患者的病情嚴重程度和發病風險預測的1個重要客觀生物標志物，為臨床診治缺血性腦卒中提供了新的思路。

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