甲基睪酮對雌核發育翹嘴鲌幼魚性別分化基因表達的影響

王 成，余秋果，劉士力，賈永義，張瑩瑩，張 婷，王在照，顧志敏

(1.浙江省淡水水產研究所 農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室/浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，浙江湖州 313001；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

翹嘴鲌(Culteralburnus)屬鯉形目，鯉科，鲌屬，俗稱白魚，主要分布于長江中下游各地區水域。該魚能把其他小型魚類轉化為高經濟價值的魚肉蛋白，屬中上層大型淡水經濟魚類，在湖泊和水庫中占有重要地位[1]。生產中發現，該魚性成熟后雌性比雄性生長快。因此，該魚的全雌化養殖對提高養殖產量和經濟效益具有重要意義。目前，該魚的全雌培育主要采用雌核發育方法，但該方法對技術要求高，操作復雜，且胚胎孵化率低[2]。誘導偽雄魚是大量生產該魚全雌性魚苗的有效途徑[3]，而雄激素的濃度和誘導關鍵時間點的選擇是該過程中的難點。因此，在該魚發育早期，了解其性別決定相關基因的表達模式，以及這些基因在雄激素誘導下的表達變化可為其性別控制提供指導。

魚類的性別決定機制主要包括遺傳決定和環境決定2種模式[4]。在遺傳決定模式中，魚類性別由常染色體和性染色體基因共同決定[5]，魚類性別在發育早期明顯地表現為雙向潛力，而性別決定基因與魚類性別分化的方向有密切關系[6]。到目前為止，還沒有關于翹嘴鲌性別決定基因的研究。據報道，抗繆勒氏管激素(amh)、芳香化酶基因( cyp19a1a)、核受體超家族0B1( dax1)、叉頭框因子L2( foxl2)、Y染色體性別決定基因( sox9)以及雙性別mab-3相關因子1( dmrt1)基因在魚類性別分化中發揮重要作用。在哺乳動物中，amh能抑制雌性生殖器官的發育，相反地，該基因能促進雄性生殖器官發育，對雄性性別分化有重要作用[7-10]。Miura等[11]從日本鰻(Anguillajaponica)未成熟的精巢細胞中鑒定出amh類似物，發現該基因可能參與性別決定和睪丸分化。 cyp19a1a是 cyp19a1的一種亞型，在卵巢組織中特異性表達，其編碼的細胞色素P450芳香化酶是類固醇合成過程中的限速酶，可催化雄激素轉化為雌激素，誘導肝臟卵黃蛋白原的合成，促進卵子發育早中期物質能量的積累，保證卵子的正常發育[12-13]。 dax1基因是位于X染色體上性反轉決定區內的一個候選基因[4]，該基因可作為一種轉錄抑制因子與其受體如雌激素受體或雄激素受體相互作用[14-15]，從而調節性腺和腎上腺的發育以及類固醇激素的合成。在羅非魚(Oreochromismossambicus)中， dax1基因在雌魚性腺中的表達量高于雄魚性腺[16]，但其在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中的表達模式卻恰好相反[17]。 foxl2基因是Forkhead/HNF-3相關轉錄因子家族的一員，參與卵巢和其他細胞的分化過程[18]；該基因也可以促進 cyp19a1的轉錄表達[19-20]。哺乳動物的 foxl2基因在卵巢中特異性表達，該基因的缺失會導致卵巢顆粒細胞發育為精巢支持細胞。羅非魚 foxl2基因在性腺分化早期開始表達直至個體成熟，參與其性腺分化的整個過程[20]。sox是一類基因的總稱，這類基因的特點是均含有SRY樣HMG盒(High mobility group box)，但不同種魚的SRY存在多樣性[21]。在多種sox基因中，僅有 sox9基因參與性別分化，斑馬魚(Daniorerio)中有2種該基因， sox9a和 sox9b，這2種基因均可與AACAAAG特異序列結合[22]。 sox9a和 sox9b在斑馬魚成魚中有不同的表達模式， sox9a基因在腦、腎、肌肉、精巢、胸鰭中均有表達；而 sox9b基因僅在卵巢中表達[23]。dmrt家族基因均具有一個鋅指樣的DNA結合結構域，這類家族基因與動物生殖器官發育和功能維持有關，在哺乳動物精巢中特異性表達，并通過DM結構域調控性別分化相關基因的表達；魚類中該基因在胚胎發育期不表達，在處于性別分化期的幼魚性腺和成魚精巢中表達量較高，而在成魚卵巢中表達量較低[12]。

本研究主要檢測amh、 cyp19a1a、 dax1、 foxl2、 sox9和 dmrt1基因在雌核發育翹嘴鲌發育早期的表達模式，探究雌核發育翹嘴鲌性腺發育的關鍵時間點；用不同質量分數MT暴露雌核發育的翹嘴鲌幼魚，檢測這些基因在不同質量分數MT和不同處理時間下表達量的變化情況，篩選誘導偽雄性翹嘴鲌的適宜激素質量分數和處理時間，為生產實踐中翹嘴鲌偽雄魚的誘導奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

2015年6月于浙江淡水水產研究所八里店養殖基地進行雌核發育翹嘴鲌的人工誘導，采用餌料拌喂法對出膜后4日齡的幼魚進行MT暴露。用乙醇噴霧法處理幼魚飼料，按照6、60 mg/kg的質量分數稱取MT(純度99.0%，D-86199 Augsburg，Germany)溶于φ=95%的乙醇中，充分溶解后噴灑在飼料粉上，對照組餌料用不含MT的相同體積的φ=95%乙醇處理，35 ℃烘干后使用。

1.2 方法

1.2.1 MT暴露與取樣 將4日齡的雌核發育翹嘴鲌幼魚，用50 L的塑料桶進行8周的暴露試驗，設置6、60 mg/kg試驗組和空白對照組，分別記為MT6、MT60和CK，每缸120尾受試魚，3 個平行。分別用含有6、60 mg/kg的MT飼料和乙醇飼料投喂，每天定時定點投喂3次，按其體質量的3%～5%投餌。暴露7、14、21、28、35、42、49和 56 d后分別取樣1次，每缸每次隨機選取15尾魚，其中5尾用于RNA提取，5尾凍存進行激素測定，5尾用于組織學檢測。在解剖前，測量魚的體長、全長和體質量等指標。

1.2.2 總RNA提取與反轉錄 按照RNAiso plus(TakaRa)試劑操作說明書提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用微量核酸測定儀檢測RNA質量，保證A260/A280的比值在1.8～2.1，用DNase I(TakaRa)消化處理去除DNA污染。按照M-MLV First Strand cDNA Kit(Invitroge)說明書合成cDNA第1鏈。

1.2.3 引物合成 利用翹嘴鲌轉錄組數據庫中的amh、 dax1、 cyp19a1a、 foxl2、 dmrt1基因序列，設計實時熒光定量PCR引物(表1)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.4 內參基因的選擇 選擇2個穩定的內參基因β-actin和 ef1a，計算2個內參基因的幾何平均值[24]，建立標準曲線對目的基因和內參基因進行定量。內參基因引物序列見表2。

1.2.5 實時定量 PCR 采用qRT-PCR 技術測定目的基因的表達量。qRT-PCR 的反應體系為:SYBR Premix ExTaq(Invitrogen)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL，總體積為25 μL，每個樣品重復 3 次。PCR反應程序為:95 ℃預變性30 s，40個循環(95 ℃變性5 s；60 ℃退火及延伸30 s)。做熔解曲線,確定引物及反應是否正常。

表1 目的基因的實時定量 PCR檢測引物序列Table 1 Primers of the target genes for quantitative real time PCR

表2 內參基因的實時定量 PCR檢測引物序列Table 2 Primers of the housekeeping genes for quantitative real time PCR

1.2.6 激素水平測定 采用ELISA方法檢測翹嘴鲌幼魚全魚睪酮(T)、11-酮基睪酮(11-KT)以及雌二醇(E2)水平(上海鑫樂科技有限公司)，由于幼魚較小無法采集足夠血液，因此測試樣品為全魚的組織研磨液。測定方法按試劑盒說明書進行。

1.2.7 翹嘴鲌性腺組織形態學觀察 用Bouin氏液固定翹嘴鲌幼魚全魚(去頭尾)，酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度8 μm，H.E.染色，光學顯微鏡下觀察其性腺發育狀況。

1.3 數據處理和統計分析

qRT-PCR數據處理采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=處理組(Ct目的基因-Ct內參)-對照組(Ct目的基因-Ct內參)。試驗數據表示形式為“平均值±標準誤”，用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 MT對翹嘴鲌幼魚體長、體質量和全長的影響

由圖1可知，MT6組幼魚的全長和體質量在暴露28～56 d均顯著高于CK組和MT60組(P<0.05)，而幼魚體長在14～56 d顯著高于CK組和MT60組(P<0.05)。在整個暴露過程中，MT60組幼魚的體質量相對于CK組有增加趨勢，在處理56 d時體質量顯著增加(P<0.05)。

2.2 性別分化相關基因在不同發育時期的相對表達量

由圖2可知，在不同發育時期，翹嘴鲌幼魚性別發育相關基因的表達模式不同。 dmrt1基因在4～60日齡幼魚的發育過程中表達量均較低； foxl2基因在39～53日齡幼魚中的表達量先增加后降低，但總體均高于其他發育時期；amh、 cyp19a1a和 dax1基因在46～60日齡幼魚中的表達量先增加后降低，但總體均高于其他發育時期；而 sox9b在46～60日齡幼魚中的表達量先降低后增加，但總體均高于其他發育時期。從性別發育相關基因在不同發育階段的表達模式來看，在46～53日齡幼魚中，性別分化相關基因的表達量均高于其他發育時期，表明46～53日齡可能是雌核發育翹嘴鲌卵巢發育的關鍵時期。

2.3 MT對翹嘴鲌性別分化相關基因表達的影響

如圖3所示，不同質量分數MT暴露翹嘴鲌后，MT60組amh表達量在處理21 d時顯著增加，處理35 d時顯著降低(P<0.05)；42和49 d時，MT6和MT60組均顯著低于CK組(P<0.05)。對于 dax1基因，在處理49 d時，2種質量分數MT均顯著抑制其表達，而在28 d時，MT6組的表達量也被顯著抑制(P<0.05)。處理21和28 d時，MT60組 cyp19a1a的表達量顯著上調(P< 0.05)；而在42和49 d 時， 2 個MT組均顯著下調(P< 0.05)。在整個暴露期間，翹嘴鲌 dmrt1的表達量一直維持較低水平，處理28 d 時，MT6組顯著下降，而處理42 d時，MT6和MT60組均顯著下降(P<0.05)。對于 foxl2基因，處理21和28 d時，MT60組均顯著上調(P<0.05)；而處理42 d時，2個MT處理組均顯著下調(P<0.05)；暴露至49 d時，2個MT處理組均顯著上調(P<0.05)；而在56 d時，MT60組的維持顯著的高水平(P<0.05)。暴露42 d時，2個 MT處理組 sox9b表達量均顯著降低(P<0.05)；而在21 d和49 d時，MT60組顯著上調(P<0.05)。

*. 表示不同組間差異顯著(P<0.05)，下同 Indicates significantly difference(P<0.05),the same below

圖2 不同發育時期性別分化相關基因的相對表達量Fig.2 Expression of sex differentiation related genes in different development periods

2.4 MT對翹嘴鲌性激素水平的影響

如圖4所示，在MT處理28 d時，MT6組和MT60組的E2水平均顯著升高，在42和49 d時，MT60組顯著降低(P<0.05)，而處理至56 d時，MT6組顯著升高(P<0.05)。MT暴露21～56 d，2個MT組幼魚中T的水平均顯著降低，尤其在42～56 d，T水平與MT質量分數和暴露時間呈反比(P<0.05)。MT60組11-KT水平在第21天顯著增加，而在第49天顯著降低(P<0.05)；MT6組11-KT水平在第28天、42天和56天均顯著增加(P<0.05)。4～60日齡的翹嘴鲌全魚組織學觀察均未發現性腺組織(圖4)。

圖3 MT暴露下翹嘴鲌幼魚性別分化相關基因表達Fig.3 The relative expression of sex differentiation related gene in C.alburnus juveniles under MT exposure

3 討 論

Higgs等[25]的研究結果表明，激素類藥物能明顯提高飼料轉化率，并促進魚類生長。本研究也發現低質量分數MT(6 mg/kg)處理翹嘴鲌超過28 d后，能顯著增加幼魚體長、全長和體質量，這表明適宜質量分數的MT能促進翹嘴鲌的生長，但這種促進作用與MT的質量分數并不呈正比，當質量分數過高時，這種促進作用反而減弱。

在虹鱒稚魚和鯉魚(CyprinuscarpioLinnaeus)的暴露試驗中，當MT的質量分數小于10 mg/kg時，幼魚體長與體質量均顯著增加，但當MT的質量分數高于10 mg/kg時，反而會抑制幼魚的生長[26-27]。

圖4 翹嘴鲌幼魚性激素水平Fig.4 Sex hormone levels in C.alburnus juveniles

不同種魚類性腺形成的時期不同，黃顙魚在14日齡時卵巢開始分化，隨后逐步形成卵巢腔[28]。斑馬魚在25日齡時出現卵巢結構[29]。黃姑魚在36日齡時原始生殖細胞開始進行有絲分裂，40日齡時已經能夠觀察到典型的卵母細胞，在46日齡時可觀察到卵巢腔[30]。而半滑舌鰨在62日齡時卵巢才開始分化，至120日齡時形成明顯的卵巢腔[31]。本研究中，組織切片中未觀察到卵巢組織，表明翹嘴鲌的性腺發育可能相對較晚。然而在46～53日齡的幼魚中，性別分化相關基因amh、 sox9b、 dax1、 cyp19a1a和 foxl2的表達量均高于其他發育時期，表明該階段可能是雌核發育翹嘴鲌性腺分化的關鍵時期。

在雄性性腺分化期，amh可抑制繆勒氏管的形成和雌性生殖器官的發育，使中腎管發育為雄性生殖器官，是重要的性別分化因子[32-33]。哺乳動物的 dax1基因位于X染色體上性反轉決定區，可抑制睪丸的發育[4]。在魚類中， dax1在雌雄魚性腺中均有表達，但表達量因物種而異[15-17]。在本研究中，amh和 dax1基因在MT處理下的表達模式十分相似，所以筆者推測，翹嘴鲌 dax1的功能可能與amh相似。此外，長時間MT處理下，這2個基因均能降低表達量以抵抗MT對卵巢發育的抑制作用。 dmrt1參與精巢功能的維持，在MT處理后引發性反轉的雌性半滑舌鰨性腺中， dmrt1的表達量顯著升高[34]。本研究中， dmrt1基因在4～60 d的發育過程中表達量一直較低，這可能是由于受試魚均為雌魚；但在MT暴露早期(7～14 d)， dmrt1的表達量有所升高，這與在半滑舌鰨上的研究結果相一致[34]；在暴露后期(21～56 d)， dmrt1的表達量反而降低，這可能與機體對MT的反饋調節作用有關。

cyp19a1a基因是催化內源性雄激素轉化為雌激素的關鍵酶，研究中發現，乙炔雌二醇能顯著抑制稀有鮈鯽 cyp19a1a基因的表達[35]。而本研究中，在MT暴露的7～56 d， cyp19a1a的表達量也發生顯著變化。 foxl2基因是極少數保守的卵巢分化基因，能促進哺乳動物和魚類 cypl9ala基因的表達[36-37]。本研究中，在MT暴露的7～42 d， cyp19a1a表達受到的調控與 foxl2較為一致，這表明MT可能通過影響 foxl2的表達調節 cypl9ala的表達。此外， sox9b與 foxl2也有著類似的表達模式，表明雌核發育的翹嘴鲌中這2種基因可能存在比較密切的關系， sox9b可能也參與 cypl9ala的表達調控。與 cypl9ala基因表達量的變化一致，翹嘴鲌幼魚的E2、T以及11-KT水平也發生顯著變化，受MT處理的影響，T的水平與MT質量分數和暴露時間呈反比，這表明外源性雄激素MT抑制機體內源性雄激素T的合成。機體內的E2和11-KT均是由T轉化而來，而在本研究中，6 mg/kg 的MT能升高E2和11-KT的水平，表明低質量分數MT可促進機體T向E2和11-KT轉化；但60 mg/kg的MT反而會降低E2和11-KT水平，這表明過高質量分數的外源雄激素MT可能會干擾機體類固醇激素的合成。

性腺分化時間的確定對性反轉過程十分關鍵，類固醇激素可在性別分化前有效地誘導魚類性別的轉變，本研究結果表明，雌核發育翹嘴鲌卵巢發育的關鍵時期可能在46～53日齡。之前的研究表明，用含有30～60 mg/kg 17α-甲基睪酮的餌料連續投喂莫桑比克羅非魚(Tilapiamossambica)3～4周能有效誘導其向雄性轉化[38]；而用含50和100 mg/kg雄激素的餌料處理異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)，不僅不能使其向雄性轉化，反而會使其性腺萎縮，使卵巢發育受到抑制[39]。這表明雄激素的濃度對魚類性腺轉化具有關鍵作用。在本研究56 d的暴露試驗中，6和60 mg/kg MT對幼魚生長、性別分化相關基因的表達模式以及內源性T水平的影響較為一致，這表明60 mg/kg的質量分數并沒有達到過量抑制的效果。而在60 mg/kg MT處理下，E2水平下降，表明MT可能抑制翹嘴鲌卵巢發育。

參考文獻Reference:

[1] 王 偉. 翹嘴鲌(Culteralbunus)群體遺傳多樣性及鲌亞科魚類系統發生的研究[D].上海:華東師范大學,2007.

WANG W.Study on population genetie diversity of (Culteralbunus) and phylogeny of Cultrinae[D].Shanghai:East China Normal University,2007.

[2] 李 停,賈永義,劉士力,等.二次正交旋轉組合設計優化人工誘導翹嘴鲌雌核發育[J].中國水產科學,2016,23(1):77-89.

LI T,JIA Y Y,LIU SH L,etal.Optimizing conditions to induce artificial gynogenesis inCulteralburnususing a quadratic orthogonal rotation design[J].JournalofFisherySciencesofChina,2016,23(1):77-89.

[3] 徐竹青.牙鲆全雌化研究的新進展[J].中國水產,2005(8):80-80.

XU ZH Q.New process of feminization ofBastardhalibut[J].ChinaFisheries,2005(8):80-80.

[4] 鄭 堯,王在照,陳家長.調控魚類性腺分化基因的研究進展[J].水生生物學報,2015,39(4):798-810.

ZHENG Y,WANG Z ZH,CHEN J ZH.Progressess on the study of sex difference genes in fish[J].ActaHydrobiologicaSinica,2015,39(4):798-810.

[5] JRGENSEN A,MORTHORST J E,ANDERSEN O,etal.Expression profiles for six zebrafish genes during gonadal sex differentiation[J].ReproductiveBiologyandEndocrinology,2008,6(5):181-190.

[6] 王德壽,吳天利.魚類性別決定及其機制的研究進展[J].西南師范大學學報(自然科學版),2000,25(3):296-304.

WANG D SH,WU T L.Fish sex determination and its mechanisms:a review[J].JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScienceEdition),2000,25(3):296-304.

[7] GIUILI G,SHEN W H,INGRAHAM H A.The nuclear receptor SF-1 mediates sexually dimorphic expression of Müullerian inhibiting substance,in vivo[J].Development,1997,124(9):1799-1807.

[8] LEE M M,DONAHOE P K.Müllerian inhibiting substance:a gonadal hormone with multiple functions[J].EndocrineReviews,1993,14(2):152-164.

[9] MNSTERBERG A,LOVELLBADGE R.Expression of the mouse anti-mullerian hormone gene suggests a role in both male and female sexual differentiation[J].Development,1991,113(2):613-624.

[10] LANE,ANDREW H,LEE,etal.Müllerian inhibiting substance:a nontraditional marker of gonadal function[J].CurrentOpinioninEndocrinologyDiabetesandObesity,2001,8(6):296-300.

[11] MIURA T,MIURA C,KONDA Y,etal.Spermatogenesis-preventing substance in Japanese eel[J].Development,2002,129(11):2689-2697.

[12] 文愛韻,尤 鋒,徐永立,等.魚類性別決定與分化相關基因研究進展[J].海洋科學,2008,32(1):74-80.

WEN A Y,YOU F,XU Y L,etal.Research progress on the study of sex determination and differentiation relateds to gene of fish[J].MarineSciences,2008,32(1):74-80.

[13] DEVLIN R H,NAGAHAMA Y,DEVLIN R H,etal.Sex determination and sex differentiation in fish:an overview of genetic,physiological,and environmental influences[J].Aquaculture,2002,208(3/4):191-364.

[14] ZHANG H,THOMSEN J S,JOHANSSON L,etal. DAX-1 functions as an LXXLL-containing corepressor for activated estrogen receptors[J].JournalofBiologicalChemistry,2000,275(51):39855-39859.

[15] HOLTER E,KOTAJA N,MKELA S,etal.Inhibition of androgen receptor(AR) function by the reproductive orphan nuclear receptor DAX-1[J].MolecularEndocrinology,2002,16(3):515-528.

[16] WANG D S,KOBAYASHI T,SENTHILKUMARAN B,etal.Molecular cloning of DAX1 andSHPcDNAs and their expression patterns in the Nile tilapia,Oreochromisniloticus[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2002,297(3):632-640.

[17] BARON D,HOULGATTE R,FOSTIER A,etal.Large-scale temporal gene expression profiling during gonadal differentiation and early gametogenesis in rainbow trout[J].BiologyofReproduction,2005,73(5):959-966.

[18] CARLSSON P,MAHLAPUU M F.Transcription factors:key players in development and metabolism [J].DevelopmentalBiology,2002,250(1):1-23.

[19] SRIDEVI P,CHAITANYA R K,DUTTA-GUPTA A,etal. FTZ-F1 and FOXL2 up-regulate catfish brain aromatase gene transcription by specific binding to the promoter motifs[J].BiochimicaetBiophysicaActa-Biomembranes,2012,1819(1):57-66.

[20] YOSHIURA Y,SENTHILKUMARAN B,WATANABE M,etal.Synergistic expression of Ad4BP/SF-1 and cytochrome P-450 aromatase(ovarian type) in the ovary ofNiletilapia,Oreochromisniloticus,during vitellogenesis suggests transcriptional interaction[J].BiologyofReproduction,2003,68(5):1545-1553.

[21] 張 悅,魯曉萱,單祥年.性別決定基因的研究進展[J].遺傳,2000,22(5):328-330.

ZHANG Y,LU X X,SHAN X N.Progress in research on sex determinating genes[J].Hereditas,2000,22(5):328-330.

[22] CHIANG F L,PAI C I,WYATT M,etal.Two sox9 genes on duplicated zebrafish chromosomes:expression of similar transcription activators in distinct sites[J].DevelopmentalBiology,2001,231(1):149-163.

[23] 陳 蕓,王藝磊,田 佳,等.斑馬魚性別決定相關基因的表達分析[J].水生態學雜志,2010,3(5):10-16.

CHEN Y,WANG Y L,TIAN J,etal.Expression analysis of genes which related to sex determination of zebrafish[J].ReservoirFisheries,2010,3(5):10-16.

[24] VANDESOMPELE J,PRETER K D,PATTYN F,etal.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].GenomeBiology,2002,3(7):0034.1-0034.11.

[25] HIGGS D A,FAGERLUND U H,MCBRIDE J R,etal.Influence of combinations of bovine growth hormone,17 alpha-methyltestosterone,and L-thyroxine on growth of yearling coho salmon(Oncorhynchuskisutch)[J].CanadianJournalofZoology,1977,55(6):1048-56.

[26] 馬尚助,于凌杰,劉明波,等.應用17α-甲基睪丸酮促進虹鱒稚魚生長的試驗[J].淡水漁業,1990(4):6-7.

MA SH ZH,YU L J，LIU M B,etal.The growth experiment of 17 alpha methyl testosteroneOncorhynchusmykissjuvenile[J].FreshwaterFisheries,1990(4):6-7.

[27] 任維美.投喂含雄性激素飼料可有效提高鯉魚產量[J].國外水產,1989(3):45-45.

REN W M.Effectively improve the production of feeding containing testosterone feed carp[J].ForeignFisheriesPeriodicals,1989(3):45-45.

[28] 王 晶,王 冰,李紀同,等.斑馬魚性腺發育的組織學觀察[J].基因組學與應用生物學，2011,30(2):168-174.

WANG J,WANG B,LI J T,etal.Histological observation of zebrafish gonad development[J].GenomicsandAppliedBiology,2011,30(2):168-174.

[29] 彭麗娜,盧建國,欒培賢,等.黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)性腺分化的組織學觀察[J].水產學雜志,2014,27(3):48-51.

PENG L N,LU J G,LUAN P X,etal.Observation on gonadal differentiation in Yellow CatfishPelteobagrusfulvidraco[J].ChineseJournalofFisheries,2014,27(3):48-51.

[30] 耿 智.黃姑魚早期生長和性腺發育研究[D].浙江舟山:浙江海洋學院,2012.

GENG ZH.Research on the early growth and gonad development of the spotted maigreNibeaalbiflora[D].Zhoushan Zhejiang:Zhejiang Ocean University,2012.

[31] 馬學坤,柳學周,溫海深,等.半滑舌鰨性腺分化的組織學觀察[J].漁業科學進展,2006,27(2):55-61.

MA X K,LIU X ZH,WEN H SH,etal.Histological observation on gonadal sex differentiation inCynoglossussemilaevisGunther[J].MarineFisheriesResearch,2006,27(2):55-61.

[32] 劉姍姍.半滑舌鰨AMH基因的克隆及表達分析[D].上海:上海海洋大學,2012.

LIU SH SH.Molecular cloning and expression analysis ofAMHgene fromCynoglossussemilaevisGunther[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2012.

[33] 蔣香菊,吳陽升,張 利,等.羔羊卵巢AMH的免疫組織化學分析[J].西北農業學報,2014,23(7):19-24.

JIANG X J,WU Y SH,ZHANG L,etal.Immunocy tochemical study of anti-Miillerianhormone in ovarian follicles from lambs[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2014,23(7):19-24.

[34] 鄧思平,陳松林.半滑舌鰨 Dmrt1α基因的cDNA克隆及其表達[J].中國水產科學,2008,15(4):577-584.

DENG S P,CHEN S L.Molecular cloning and expression of Dmrt1 α gene fromCynoglossussemilaevisGunther[J].JournalofFisherySciencesofChina,2008,15(4):577-584.

[35] 王晶晶,劉小林,秦 芳,等.稀有鮈鯽芳香化酶基因的表達及內分泌干擾物(EDCs)暴露對其表達的影響[J].西北農業學報,2011,20(1):35-39.

WANG J J,LIU X L,QIN F,etal.Expression of cytochrome P450 aromatase genes and effects of EDCs exposure on their expression in rare minnow(Gobiocyprisrarus)[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2011,20(1):35-39.

[36] WANG D S,KOBAYASHI T,ZHOU L Y,etal. Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with ad4 binding protein/steroidogenic factor 1[J].MolecularEndocrinology,2007,21(3):712-725.

[37] MARINA S G,MALLE P,PAILHOUX E,etal.Isolation of chicken homolog of the FOXL2,gene and comparison of its expression patterns with those of aromatase during ovarian development [J].DevelopmentalDynamics,2004,231(4):859-870.

[38] 鄔國民,練慧英.應用甲基睪丸素誘導莫桑非洲鯽雄性化的研究[J].遺 傳,1979,1(6):36-39.

WU G M,LIAN H Y.Research on the application of methyl testosterone inducing mozambique’s African carp male-like[J].Hereditas,1979,1(6):36-39.

[39] 張甫英,胡 煒,汪亞平,等.應用雄性激素誘導異育銀鯽性轉化的研究[J].遺 傳,2000,22(1):25-27.

ZHANG F Y,HU W,WANG Y P,etal.Methyltestosteroneinduction of sex reversal in allogynogenetic crucian carp[J].Hereditas,2000,22(1):25-27.