葉噴不同水平氮肥對蘋果果實淀粉和糖及代謝相關酶活性的影響

溫志靜，郭延平，張 雯，毛海燕，梁 俊

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

影響蘋果品質的因素有很多，其中肥料是重要因素[1]。氮素是植物必需的大量營養元素之一,是果樹生長的重要物質基礎,對果樹的器官建造、物質代謝、生化過程、果實產量及品質的形成等都有不可替代的作用,被稱為“生命元素”[2]。

馮煥德等[3]研究發現，適量施氮能提高果實品質，但施用氮肥不當可以導致果實品質下降、樹體旺長等不良后果[4]。有關果實中糖的積累及其與蔗糖代謝相關酶的關系在蘋果[5]、葡萄[6]、杏[7]、梨[8]等植物中有所研究。果實中淀粉也是影響蘋果品質的重要指標，目前氮如何調控蘋果中淀粉代謝進而影響果實品質的研究報道較少。為此，本試驗以5 a生盆栽‘嘎啦’蘋果為試材，通過葉面噴施不同質量分數的尿素來研究其對蘋果果實中淀粉和可溶糖(果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇)及相關酶的影響，探討其與果實品質的關系，以期為蘋果優質生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年3-11月在西北農林科技大學進行。以5 a生的盆栽‘嘎啦’蘋果/‘M26’自根蘋果苗為試材，栽于盆高45 cm×直徑50 cm 的塑料盆中，基質為園地表層壤土與腐熟的糞肥混合土，質量比為2∶1。試驗所用果樹每棵植株每年果實負載量約為 27～35個，土壤營養狀況為：土壤 pH 7.2，堿解氮 100.5 mg·kg-1，速效磷 30.2 mg·kg-1，速效鉀88.65 mg·kg-1，有機質 26.73 g·kg-1。

1.2 試驗設計

在西北農林科技大學園藝場選取生長狀況一致、負載量相近的40棵‘嘎啦’蘋果樹，不套袋共設4個處理：噴施純水(CK),噴施w=0.1%的尿素(N1), 噴施w=0.3%的尿素(N2)，噴施w=0.5%的尿素(N3)。每個處理10個重復，完全隨機區組設計?；ê?5 d開始第1次噴施氮肥，以后每隔1周噴施1次,共噴施6次。噴施時間為10：00之前，每次噴到樹下有水滴滴下為止，噴完1周后取樣，樣品削果皮后進行各指標的測定。各處理充分灌水，防止水分虧缺，除草，修剪，打藥等田間管理要求一致。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 果實發育動態的測定 用電子天平(精確到0.001 g)測量采樣鮮果的單果質量。

1.3.2 果實中N質量分數測定 稱取削去果皮后的烘干果實0.3 g，用H2SO4-H2O2消煮法進行消煮，連續流動分析儀進行測定。

1.3.3 果實中多糖質量分數測定 可溶性糖的提取和測定：準確稱取1.00 g果實凍樣，加入3 mLφ=80%乙醇，80 ℃ 水浴超聲波提取30 min，12 000 g離心10 min，取上清液后，再向沉淀中加入2 mLφ=80%的乙醇，重復2次，上清液合并至一起，于55 ℃烘干，2 mL超純水復溶，0.22 μm濾膜過濾后測定果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇的質量分數。測定儀器為LC-10ATVP (Shimadzu，Kyoto，Japan)，色譜條件參考Suárez等[9]的方法。

淀粉的提取與測定：提取可溶性糖后的沉淀物用于提取淀粉，淀粉的測定參考Sanz等[10]的方法。

1.3.4 果實中蔗糖代謝和山梨醇代謝相關酶液的提取與測定 NAD+-山梨醇脫氫酶(NAD+-SDH)酶液提取和活性測定參照 Park等[11]的方法。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合酶-分解方向(SS)、山梨醇氧化酶(SOX)、酸性轉化酶(AI)及中性轉化酶(NI)酶液制備依據 Keller等[12]的方法。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性測定方法參考 Zhou等[13]的方法。

酸性轉化酶(AI)、中性轉化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)以及山梨醇氧化酶(SOX)酶活性測定參考 Lowell等[14]的方法。

1.3.5 果實中淀粉代謝相關酶活的提取與測定 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的提取與測定：酶液提取和測定依據Nakamura等[15]的方法。

α-淀粉酶，β-淀粉酶的提取與測定：酶液的提取和測定依據Santelia等[16]的方法。

1.4 數據處理

數據采用Excel 2003和Origin 9.0進行統計分析與制圖，采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同水平N處理對蘋果果實發育過程中N質量分數的影響

在‘嘎啦’蘋果果實的發育過程中，果實中N的質量分數呈下降趨勢(圖1)。從圖1中可以看出，與噴施純水(CK)相比，噴施不同質量分數的尿素，果實中N的質量分數均有不同程度地升高。其中噴施N3的果實中N的質量分數最高，N2、N1次之。可見，氮肥的施用量越大，蘋果果實中氮質量分數越高。

圖1 不同水平N對蘋果果實發育過程中氮質量分數的影響Fig.1 Effect of different nitrogen levels on nitrogen mass fraction in fruit during development of apple fruit

2.2 不同水平N處理對蘋果果實發育動態的影響

‘嘎啦’蘋果果實發育單果質量變化呈“慢-快-慢”的單S曲線變化(圖2)。從圖2中可以看出，在花后35～65 d間，各處理的單果質量均緩慢增加；隨著果實的發育，在花后65～110 d間，單果質量迅速增加；花后110 d后，單果質量增長又逐漸平緩。與CK相比，噴施尿素后蘋果單果質量提高，且隨施氮量的增加，蘋果果實的單果質量也逐漸增大。到花后125 d，N1、N2及N3相比CK分別提高10.3%、23.7%、46.4%?？梢?，施氮可以促進果實的生長。

2.3 不同水平N處理對蘋果果實發育過程中淀粉質量分數的影響

‘嘎啦’蘋果果實發育的淀粉質量分數變化呈“倒V形”，先上升后下降(圖3)。從圖3中看出，CK果實的淀粉質量分數在花后65 d達到最大值，但經氮處理后，果實中淀粉質量分數的高峰值均在花后80 d，推遲15 d，說明氮推遲淀粉的合成和降解時間。從圖中的結果看出，在花后65 d，各處理間淀粉最大質量分數排序依次為CK>N2>N1> N3，原因是花后65 d時，CK的淀粉合成達到最大值，而N處理的淀粉還處于合成階段。在花后80 d，各處理間淀粉質量分數依次為N2>N1> N3> CK，因為此階段時CK的淀粉已經開始降解，而N處理后的淀粉合成達到最大值。隨著果實的成熟，果實中淀粉質量分數逐漸下降，而且遠低于花后35 d的幼果期；在花后125 d 時，N3處理的淀粉質量分數最大。

圖2 不同水平N對蘋果果實發育過程單果質量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen levels on mass per fruit during development of apple fruit

2.4 不同水平N處理對蘋果果實發育過程中可溶性糖質量分數的影響

隨著蘋果果實的發育，果實中果糖、葡萄糖及蔗糖質量分數上升，山梨醇質量分數下降，而且果糖質量分數最高，其次是蔗糖、葡萄糖，山梨醇質量分數最少(圖4)。

圖3 不同水平N對蘋果果實發育過程中淀粉質量分數的影響Fig.3 Effect of different nitrogen levels on starch mass fraction during development of apple fruit

同一取樣時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同 Different letters at same sampling time mean significant difference(P<0.05).The same below

從圖4-A中可以看出，與CK相比，N2處理后其果實中的果糖質量分數顯著升高，N1處理只有在花后65～80 d和花后110 d果實中果糖質量分數升高明顯；N3處理在花后95 d前果實中的葡萄糖質量分數與CK沒有差異，而且近成熟期(花后95 d)果實中的果糖質量分數顯著下降。不同水平氮處理后，果實中蔗糖質量分數變化與果糖變化略有不同，在花后65 d前，與CK相比，N2處理蔗糖質量分數較低，花后80 d后蔗糖質量分數較CK高(圖4-B)。不同水平氮處理后，蘋果果實中葡萄糖質量分數的變化與果糖變化類似(圖4-C)。在果實發育階段，山梨醇質量分數變化呈下降趨勢，且高水平的N3處理，其果實中山梨醇質量分數最高，而N2處理的山梨醇質量分數最低(圖4-D)。

2.5 不同水平N處理對蘋果果實發育過程中淀粉代謝相關酶活性的影響

從圖5可以看出，果實發育到花后65 d期間，CK的AGPase活性呈上升趨勢，花后65 d后其活性逐漸下降；氮處理后AGPase活性在花后80 d達到最大值，隨后逐漸下降(圖5-A)。從圖5-A中可以看出，與CK相比，花后50 d時，施用適宜質量分數的氮肥，AGPase活性增加，合成更多的淀粉；過量的氮肥AGPase活性降低。

與AGPase活性變化相反，蘋果果實發育過程中α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性呈上升趨勢，在成熟期略有下降，而且在整個果實發育期α-淀粉酶活性比β-淀粉酶活性高(圖5-B，5-C)。從圖中還可以看出，花后80 d時，CK的α-淀粉酶和β-淀粉酶活性較高，與圖3中花后80 d時CK處理已經開始降解，而氮處理還在合成階段一致；與CK相比，施用適宜質量分數的氮肥，提高α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性；過量的氮肥，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性降低。

2.6 不同水平N對蘋果果實發育過程中蔗糖代謝和山梨醇代謝相關酶活性影響

圖6-A中隨著果實的發育AI活性呈下降趨勢，花后50 d最高，此后急劇下降，到成熟后期趨于穩定水平。與CK相比，適宜質量分數的氮處理后的AI活性提高，其中N2處理的酶活性最大，且與CK相比差異性顯著；氮素過量，其活性下降。圖6-B中，SS(分解方向)活性隨果實發育呈下降趨勢。不同氮處理后，SS酶活的變化與AI類似。圖6-C中，NI活性整體變化較小，氮處理對其影響較小。

圖5 不同水平N對蘋果果實生長發育中淀粉代謝相關酶活性的影響Fig.5 Effect of different nitrogen levels on changes of starch metabolism related enzymes activities during development of apple fruit

從圖6-D中看出，SPS活性前期較低，花后95 d開始迅速升高，至110 d達到最大值，此后略有下降。不同氮處理后，SPS酶活的變化與AI類似。

從圖6-E中可以看出，蘋果生長前期，SDH活性先升高，花后65 d達到最大值后逐漸下降，花后95 d后又逐漸升高，至成熟期維持在恒定的水平。與CK相比，適宜質量分數的氮處理，SDH酶活升高，N2處理的SDH酶活最大，除花后125 d 外，與CK均有顯著性差異；氮素過量，其活性下降。圖6-F中，SOX活性緩慢上升并趨于穩定，各處理間差異不顯著。相比SDH，SOX活性較低，說明蘋果果實山梨醇的轉化與SDH密切相關。

圖6 不同水平N對蘋果果實生長發育過程中蔗糖和山梨醇代謝相關酶活性的影響Fig.6 Effect of different nitrogen levels on changes of sucrose metabolism and sorbitol metabolism related enzymes activities during development of apple fruit

2.7 果實中N質量分數與糖代謝相關酶活性的相關性

果實發育過程中氮與糖代謝相關酶的相關性分析結果(表1)表明，在花后50 d時氮與AGPase具有顯著相關性，在花后65、80 d 時具有極顯著相關性；在花后80 d時，氮與α-淀粉酶和β-淀粉酶具有極顯著相關性，在花后95 d時呈顯著相關性；在花后95、110 d氮與SPS具有顯著相關性；在花后50、65 d時，氮與AI、SS(分解方向)呈顯著相關性；花后 65、80 d 時，氮與SDH具有顯著相關性；在整個發育期內，氮與 NI、SOX無顯著相關性。

3 討 論

蘋果光合同化產物以蔗糖和山梨醇的形式運輸到果實中，其中以山梨醇為主。糖被運輸至果實后，除少部分用于維持生長與生命活動外，大部分通過山梨醇代謝、蔗糖代謝和淀粉代謝等糖代謝途徑轉變為淀粉和其他可溶性糖儲藏在果實內[17]?！吕病O果果實以果糖積累最多，蔗糖、葡萄糖次之，其中果糖甜度最大，在一定程度上決定蘋果的風味[18]。

表1 不同生長發育時期N水平對糖代謝相關酶相關性分析Table 1 Correlation coefficient between nitrogen and related enzymes activities in different time points during development of apple fruit

試驗中噴施氮肥后，蘋果果實中氮的質量分數均隨處理變化，糖和相關酶出現不同程度地變化，是由于噴施尿素后，果實中的氮質量分數可以較快地反應出來，而隨植物生長期的不同，氮肥對糖和酶的影響不一樣[19]。施用氮肥均提高蘋果果實的單果質量。適宜質量分數的氮素提高成熟果實中果糖、葡萄糖、蔗糖的質量分數。但氮素過量造成成熟果實中果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數降低，果實品質下降。所以提高果實品質，不是施用氮肥越多越好，要做到合理施肥。這與Meheriuk等[20]的研究結果一致。蔗糖運到果實中在SS、AI及NI的催化下分解為果糖和葡萄糖，促使果實與韌皮部形成蔗糖濃度差，驅動組織韌皮部蔗糖的卸載[21]。SS(分解方向)在幼果發育期具有較高活性，成熟期處于較低水平[22]?；ê?80 d 之前，適宜濃度的氮素顯著提高SS分解方向的活性，可能因為SS在幼果期活性較高，分解產生較多的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)用于細胞生命基礎物質的合成，在成熟期基本不需要 UDPG，因而 SS分解方向的活性較低，噴氮對其影響較小。適宜質量分數的氮素處理提高AI的活性，促進果糖的積累，但對NI影響較小。在甘薯中有研究表明，適宜水平的氮素處理提高轉化酶及SS的活性，對蔗糖及淀粉積累有積極作用。這與本試驗中酶活性的變化結論相類似。隨著果實成熟，SPS參與蔗糖的重新合成[18]，SPS是果實中蔗糖重新合成的控制點，從圖6-D中看出，適量氮素處理提高SPS酶活性，SPS在發育成熟階段出現高峰，蔗糖質量分數在成熟階段也隨之升高。山梨醇被運到果實中，在SDH的作用下轉化為果糖被貯存或參與其他代謝[23]。本試驗中，適宜質量分數的氮素提高SDH的活性，促進山梨醇的卸載。不同物候期噴氮對 SOX 活性則無顯著影響，可能是因為蘋果果實中 SOX 活性較其他酶低，80%以上為束縛型，總活性僅為 SDH 的 1/5[24]。淀粉作為蘋果果實發育周期中碳水化合物的一種暫時貯藏形式，發育前期含量較少，發育中期增多，后期降解至成熟時幾乎完全消失[25]。本試驗中，氮素延長淀粉的合成和降解時間。適宜質量分數的氮素提高AGPase酶和α-淀粉酶，β-淀粉酶的活性，促進合成更多的淀粉，也使得合成的淀粉更快地轉化為葡萄糖。但氮素過量AGPase酶活性降低，淀粉合成減少，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性降低，抑制淀粉的轉化。

本試驗中，噴施適宜質量分數的氮提高AGPase酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶的活性，促進積累更多的葡萄糖；提高轉化酶AI、SS和SPS活性，利于更多的蔗糖和果糖合成，提高果實品質。該試驗材料為5 a生盆栽蘋果，噴施的質量分數是否適用所有的樹種，還需后續的試驗加以驗證。

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