膠紅酵母與釀酒酵母混合酒精發(fā)酵中酵母生長(zhǎng)與糖苷酶活動(dòng)力學(xué)

李?lèi)?ài)華，王星晨，彭文婷，李 朔，陶永勝,3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100)

葡萄酒酒精發(fā)酵是由非釀酒酵母引起，隨后由釀酒酵母逐步替代并完成發(fā)酵[1-2]。目前，葡萄酒酒精發(fā)酵依賴(lài)于使用商業(yè)釀酒酵母，主要由于早期接種足量的釀酒酵母(≥106cfu/mL)可以有效防止致病性微生物的繁殖增長(zhǎng)，降低破敗的風(fēng)險(xiǎn)，保證酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行[3-4]。然而商業(yè)釀酒酵母的廣泛使用限制了葡萄酒的產(chǎn)地或者品種的特性，因此一些酒莊采用自然發(fā)酵的方法進(jìn)行，即不接種任何酵母，利用存在于葡萄原料中的酵母啟動(dòng)并完成酒精發(fā)酵。自然發(fā)酵的方法雖然有潛力使所釀葡萄酒獲得獨(dú)特的風(fēng)格[5-6]，但在酒精發(fā)酵前期極易造成雜菌生長(zhǎng)，進(jìn)而破壞葡萄酒的品質(zhì)。因此許多研究者在模擬自然發(fā)酵過(guò)程中的非釀酒酵母與釀酒酵母生長(zhǎng)演變規(guī)律，控制使用優(yōu)選的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵葡萄酒，以期在發(fā)揮僅使用釀酒酵母或者采用自然發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)的情況下，同時(shí)還可以避免上述2種發(fā)酵方式的缺點(diǎn)[3, 7-10]。

目前大量研究進(jìn)行優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵葡萄酒[3]，以分析所使用的非釀酒酵母對(duì)供試酒樣多酚及顏色[7]、揮發(fā)性香氣成分[8-9]及感官品質(zhì)的影響[10]。使用優(yōu)選的非釀酒酵母和釀酒酵母混合接種發(fā)酵葡萄酒的接種方式主要分為同時(shí)接種和順序接種(先接種非釀酒酵母，隨后接種釀酒酵母)[11-14]。順序接種方案模擬自然發(fā)酵過(guò)程，即首先由接種的非釀酒酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵，并發(fā)揮非釀酒酵母的代謝特點(diǎn)來(lái)修飾供試酒樣的風(fēng)格；隨后再接種釀酒酵母，從而使酒精發(fā)酵順利完成。在此過(guò)程中，非釀酒酵母產(chǎn)生的糖苷酶比釀酒酵母產(chǎn)生的更能適應(yīng)高糖、高酸、低pH的發(fā)酵環(huán)境[15]，葡萄中的香氣糖苷前體由糖苷酶水解，釋放揮發(fā)性成分，因此在發(fā)酵前期接種的非釀酒酵母產(chǎn)生的糖苷酶有能力水解更多的糖苷結(jié)合態(tài)香氣成分，從而有助于提高葡萄酒品種香氣質(zhì)量[10, 15-18]。由于不同種屬的非釀酒酵母特性差異較大，因此不同的非釀酒酵母的接種數(shù)量以及接種時(shí)機(jī)均有差異[10-11, 13-14]，而不同的混合接種策略則會(huì)導(dǎo)致酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的改變。

混合發(fā)酵過(guò)程中不同酵母的生長(zhǎng)變化體現(xiàn)了不同種屬酵母的生長(zhǎng)特性。Moreira等[19]研究在YM培養(yǎng)基中釀酒酵母與葡萄汁有孢漢遜酵母和季也蒙有孢漢遜酵母單一及混合發(fā)酵的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示混合發(fā)酵中釀酒酵母和非釀酒酵母的濃度均可達(dá)107cfu/mL，且非釀酒酵母的生長(zhǎng)并未顯著地受到釀酒酵母的抑制。也有研究顯示，在季也蒙有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵中，葡萄汁有孢漢遜酵母和季也蒙有孢漢遜酵母會(huì)受到釀酒酵母的抑制從而使非釀酒酵母在發(fā)酵結(jié)束前提前消失[20-21]。此外，本研究前期分析在葡萄汁和模擬葡萄汁的混合發(fā)酵中，釀酒酵母對(duì)葡萄汁有孢漢遜酵母有較強(qiáng)烈的抑制作用[22]。模擬發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果證明，發(fā)酵畢赤酵母在與釀酒酵母混合發(fā)酵中也受到抑制[23]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母對(duì)非釀酒酵母的抑制或殺死作用有助于控制非釀酒酵母的一些負(fù)面作用，例如漢遜酵母屬，接合酵母屬會(huì)產(chǎn)更高含量的乙酸[3]。

目前，葡萄酒的混合菌種發(fā)酵因其對(duì)供試酒樣有增香作用而得到廣泛關(guān)注，但在發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶活的變化過(guò)程卻缺乏充分的數(shù)據(jù)支撐。因此本試驗(yàn)選擇1株由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀造與風(fēng)味化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室)前期優(yōu)選的高葡萄糖苷酶活性的膠紅酵母，監(jiān)測(cè)其與釀酒酵母在混合發(fā)酵‘愛(ài)格麗’干白葡萄酒過(guò)程中，β-葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶和木糖苷酶4種糖苷酶的活性變化，同時(shí)監(jiān)測(cè)酒精發(fā)酵過(guò)程中的酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，以期從糖苷酶活性變化規(guī)律結(jié)合酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)來(lái)評(píng)價(jià)該株優(yōu)選的膠紅酵母在葡萄酒增香釀造的應(yīng)用潛力，并優(yōu)化混合發(fā)酵的接種方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑及儀器

葡萄原料：‘愛(ài)格麗’葡萄于2016年8月末采收于中國(guó)陜西省河陽(yáng)葡萄基地。還原糖121.3 g/L，總酸7.3 g/L(以酒石酸計(jì))。

菌種：非釀酒酵母使用本實(shí)驗(yàn)室篩選的膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)：M2013660。釀酒酵母是ACTIFLORE○RF33 (Laffort, France)。

試劑：亞硫酸(6%)，D-葡萄糖，酒石酸氫鉀購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、瓊脂、果糖購(gòu)于北京Solarbio生物科技有限公司；二水合氯化鈣、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、檸檬酸、無(wú)水碳酸鈉、一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉購(gòu)買(mǎi)于四川西隴化工有限公司；蘋(píng)果酸、對(duì)-硝基苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷(98%)、對(duì)-硝基苯基-α-L-鼠李糖吡喃糖苷(98%)、對(duì)-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(98%)、對(duì)-硝基苯基-β-D-木糖吡喃糖苷(98%)購(gòu)買(mǎi)自源葉生物。

儀器：Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司，美國(guó))，TGL-16M高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國(guó))，CX31光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯有限公司，日本)，MP-250B恒溫培養(yǎng)箱(上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)，HW.SY21-KP8水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)。

1.2 葡萄酒釀造

1.2.1 葡萄酒的釀造 參照Wang等[11]的工藝。新鮮葡萄經(jīng)除梗破碎后，直接壓榨取汁，加入60 mg/L的SO2(以亞硫酸計(jì))，使用0.5 g/L的膨潤(rùn)土在5 ℃下膠澄清24 h，調(diào)整分離出的澄清汁的還原糖到187 g/L，分裝葡萄汁，待其溫度達(dá)15 ℃接種酵母(具體接種方案見(jiàn)“1.2.3”)，發(fā)酵溫度控制在15～17 ℃，發(fā)酵結(jié)束后，加入60 mg/L的SO2，滿(mǎn)罐密封儲(chǔ)藏(15 ℃)并進(jìn)行常規(guī)的穩(wěn)定處理。每24 h取樣。

1.2.2 模擬發(fā)酵汁配方 參考Contreras等[24]的配方并有修改。葡萄糖100 g/L，果糖100 g/L，檸檬酸0.2 g/L，蘋(píng)果酸3 g/L，酒石酸氫鉀2.5 g/L，磷酸氫二鉀1.1 g/L，七水合硫酸鎂1.5 g/L，二水合氯化鈣0.4 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH用氫氧化鈉溶液調(diào)至3.5，由于模擬葡萄汁的營(yíng)養(yǎng)成分含量遠(yuǎn)低于葡萄汁，因此設(shè)置模擬葡萄汁發(fā)酵溫度為25 ℃恒溫靜止發(fā)酵，以保證模擬發(fā)酵的正常進(jìn)行。每隔24 h取樣。

1.2.3 酵母接種方案 對(duì)照組(CK)：只接種2×106cfu/mL的經(jīng)過(guò)YEPD液體培養(yǎng)基活化的F33釀酒酵母。

試驗(yàn)組：采用順序接種酵母的方式接種膠紅酵母和釀酒酵母；同時(shí)接種1×106cfu /mL的經(jīng)過(guò)YEPD液體培養(yǎng)基活化3 d的膠紅酵母和1×106cfu/mL的F33(C0)；先接種1×106cfu/mL的膠紅酵母，24 h后接種1×106cfu/mL的F33(S24)；先接種1×106cfu/mL的膠紅酵母，48 h后接種1×106cfu/mL的F33(S48)；先接種1×106cfu/mL的膠紅酵母，96 h后接種1×106cfu/mL的F33(S96)。每個(gè)方案做2個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 糖苷酶酶活測(cè)定 參考Fia等[25]方法并進(jìn)行修改測(cè)定糖苷酶酶活。酒樣先經(jīng)過(guò)離心(10 000×g，4 ℃，15 min)，取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜。試驗(yàn)組：200 μL粗酶提取液加入到750 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 5.0)緩沖液中，再加入250 μL 1 mmol/L相應(yīng)的p-NPG(對(duì)-硝基苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷、對(duì)-硝基苯基-α-L-鼠李糖吡喃糖苷、對(duì)-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷、對(duì)-硝基苯基-β-D-木糖吡喃糖苷)(3份)。對(duì)照組：200 μL粗酶提取液加入到750 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH 5.0)緩沖液中，加入250 μL蒸餾水(1份)。反應(yīng)條件為：40 ℃水浴，避光準(zhǔn)確反應(yīng)30 min。然后加入1.0 mL的1 mol/L Na2CO3以終止反應(yīng)。在400 nm測(cè)其吸光度，蒸餾水調(diào)零，每個(gè)樣品重復(fù)3次，利用對(duì)-硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算酶活。糖苷酶活力單位(IU)定義為：40 ℃下1 min內(nèi)催化生成1 μmol對(duì)-硝基苯酚所要的酶量。

1.3.2 微生物計(jì)數(shù)及動(dòng)力學(xué)方程建立 葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中采樣時(shí)輕微攪動(dòng)發(fā)酵液以保證酵母在發(fā)酵汁中均勻分布，并且減小氧化風(fēng)險(xiǎn)，酵母總數(shù)的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法；模擬發(fā)酵過(guò)程中取樣前將沉淀的菌體攪動(dòng)均勻，不同酵母數(shù)量的監(jiān)測(cè)采用稀釋平板法[22]。

酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型采用Monod模型[22]，使用Logistic方程進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，Logistic方程如下：

Y=a/[1+b×exp(-k×x)]

式中，Y為x時(shí)刻菌體濃度(107cfu/mL)，a為最大菌體濃度(107cfu/mL)，b為常數(shù)，k為最大比生長(zhǎng)速率(d-1)，x為發(fā)酵時(shí)間(d)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

曲線(xiàn)圖的繪制及動(dòng)力學(xué)擬合采用OriginPro 9.0完成，采用Microsoft Excel 2013 (Microsoft,USA)進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬發(fā)酵中2種酵母的生長(zhǎng)變化

由圖1-A可知，CK中的酵母(釀酒酵母)增長(zhǎng)速度最快，在發(fā)酵第4天后進(jìn)入平衡期(約5×107cfu/mL)。C0中(圖1-B)，膠紅酵母以極低的數(shù)量水平生長(zhǎng)3 d，而釀酒酵母在第5天進(jìn)入發(fā)酵的平衡期(約5×107cfu/mL)。S24中(圖1-C)膠紅酵母以低數(shù)量水平存在4 d，從發(fā)酵第4天后，釀酒酵母開(kāi)始主導(dǎo)發(fā)酵，并在發(fā)酵第5天進(jìn)入平衡期(約5×107cfu/mL)。S48中(圖1-D)膠紅酵母生存了5 d，并且在發(fā)酵第3天膠紅酵母數(shù)量顯著上升(1×107cfu/mL)，但由于同一天接種了釀酒酵母，致使膠紅酵母的數(shù)量在第4天有降低到極低水平，并在發(fā)酵的第5天后消失，釀酒酵母則在第3天后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，開(kāi)始主導(dǎo)發(fā)酵，并在發(fā)酵第6天進(jìn)入平衡期(約6×107cfu/mL)。S96中(圖1-E)的膠紅酵母共存在7 d，并且其數(shù)量在釀酒酵母接種以前及前期保持在較高水平(約1.5×107cfu/mL)，并且在接種了釀酒酵母24 h后仍保持高水平的數(shù)量，釀酒酵母接種后很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期，并在第8到第9天進(jìn)入平衡期(約5×107cfu/mL)。

在‘愛(ài)格麗’葡萄汁酒精發(fā)酵過(guò)程中，為研究不同接種方案下的酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，試驗(yàn)監(jiān)測(cè)各處理酒樣中的酵母總數(shù)，并利用酒精發(fā)酵過(guò)程中的平衡期及以前的酵母數(shù)量，建立各接種處理的酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(圖1-F))，動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)見(jiàn)表1。由表1可知，混合發(fā)酵會(huì)降低發(fā)酵過(guò)程中的酵母最大濃度，C0和S24接種方案會(huì)提高酵母的最大比生長(zhǎng)速率，而S96順序接種降低該參數(shù)。由圖1-F可知，酵母接種初期，對(duì)照酒樣CK和同時(shí)接種酒樣C0的酵母數(shù)量增長(zhǎng)速度最快，此2酒樣在最短的時(shí)間里進(jìn)入對(duì)數(shù)期(第2天)，并分別在第5天和第4天進(jìn)入平衡期。而3種順序接種處理的酒樣(S24、S48和S96)隨著接種釀酒酵母時(shí)間的推遲，進(jìn)入對(duì)數(shù)期和平衡期的時(shí)間也在逐漸地延遲。與模擬發(fā)酵中的酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)相比，葡萄汁中的酵母生長(zhǎng)速度更快，其潛在原因可能源于葡萄汁的營(yíng)養(yǎng)成分比模擬汁中的更豐富。此外，在葡萄汁酒精發(fā)酵平衡期以后，越來(lái)越多的酵母逐漸衰亡并沉淀在發(fā)酵罐底部，因而總酵母數(shù)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶酶活的變化

為探究葡萄汁發(fā)酵中不同接種方案對(duì)發(fā)酵液中糖苷酶活性的影響，試驗(yàn)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶以及木糖苷酶的活性變化，結(jié)果如圖2所示。此外，為了更直觀(guān)地觀(guān)察到不同接種處理間的酶活差異，圖2列出了各處理酒樣中4種糖苷酶的累積酶活。

圖1 模擬汁中不同接種處理的2種酵母的生長(zhǎng)變化Fig.1 Changes of two yeasts in fermentation of synthetic grape juice under different treatments

表1 酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)Table 1 Parameters of yeasts growth kinetics

β-葡萄糖苷酶的活性(圖2-A)從發(fā)酵開(kāi)始(約1.0 mU/mL)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，在發(fā)酵第4天降到最低值(0～0.65 mU/mL)，此后酶活開(kāi)始上升直到發(fā)酵結(jié)束(1.75～2.5 mU/mL)。根據(jù)β-葡萄糖苷酶的累積酶活(圖2-B)可知，混合接種方案在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有顯著提高β-葡萄糖苷酶的活性，且CK的累積酶活從發(fā)酵的第7天后高于混合發(fā)酵酒樣。

在酵母接種初期，鼠李糖苷酶(圖2-C)的活性在CK中最高(3.87±0.027 mU/mL)。24 h后降至0.55±0.12 mU/mL，此后與C0處理的酶活變化保持一致并維持在0～1 mU/mL至發(fā)酵結(jié)束。順序接種酒樣(S24、S48、S96)的鼠李糖苷酶酶活一直處于較低水平，但值得注意的是，在釀酒酵母接種后，鼠李糖苷酶活性均有不同程度微小的提高。根據(jù)累積鼠李糖苷酶活(圖2-D)可知，順序接種處理S96從發(fā)酵第3天(4.927 3 mU/mL)后累積酶活高于CK(4.613 8 mU/mL)，處理S24在發(fā)酵的第4天后累積酶活逐漸高于C0和S48，在發(fā)酵后期S24的累積酶活接近但仍低于CK。

圖2 ‘愛(ài)格麗’葡萄汁酒精發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶變化及累積酶活Fig.2 Glycosidase and accumulated glycosidase activity during alcoholic fermentation of ecolly must

半乳糖苷酶活(圖2-E)在發(fā)酵前期(第1天到第7天)在10～14mU/mL波動(dòng)，而當(dāng)酵母生長(zhǎng)進(jìn)入衰減期后，半乳糖苷酶的活性隨之開(kāi)始降低。根據(jù)半乳糖苷酶累積酶活(圖2-F)可知，不同接種處理間無(wú)顯著差異，但隨著發(fā)酵進(jìn)行，S24和S48的累積酶活逐漸高于其他處理。

順序接種處理S24(4.423 9 mU/mL)、S48(9.783 7 mU/mL)、S96(9.717 3 mU/mL)在發(fā)酵第1天的木糖苷酶活顯著高于C0和CK酒樣(圖2-G)，然而在第2天，S24、S48、S96的酶活則降低至與C0和CK相同的水平，且所有酒樣的木糖苷酶活在隨后的發(fā)酵過(guò)程中一直處于較低的水平。由木糖苷酶累積酶活(圖2-H)可知，源于發(fā)酵早期相對(duì)更高的酶活，順序接種處理S96和S48中木糖苷酶活性顯著地高于S24，并且S24的累積酶活顯著高于CK和C0，即膠紅酵母的接種在發(fā)酵早期顯著提高葡萄汁中木糖苷酶的活性。綜上所述，膠紅酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵提升了鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶和木糖苷酶的活性。

3 討 論

膠紅酵母屬于紅酵母屬，由于紅酵母沒(méi)有酒精發(fā)酵能力[26]，因此，對(duì)紅酵母在葡萄酒酒精發(fā)酵中的應(yīng)用少有研究，Mingorance-Cazorla等[27]使用1株膠紅酵母單一發(fā)酵葡萄汁和橘汁，但結(jié)果證明其所使用的膠紅酵母不能提高揮發(fā)性香氣成分的含量，也沒(méi)有表現(xiàn)出感官上的增香特點(diǎn)。本研究所使用的膠紅酵母是從河北葡萄酒產(chǎn)區(qū)篩選的高β-葡萄糖苷酶活性酵母，Hu等[28]證明從本株膠紅酵母提取的糖苷酶粗酶對(duì)高濃度的葡萄糖，或高濃度的乙醇，或低pH等環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，從膠紅酵母中提取的糖苷酶粗酶能有效水解香氣糖苷前體；Wang等[11]利用此株膠紅酵母與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵‘愛(ài)格麗’干白葡萄酒，結(jié)果表明接種混合發(fā)酵的酒樣具有更高含量的揮發(fā)性香氣成分，尤其C6-化合物、萜烯類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯類(lèi)、高級(jí)醇、酯類(lèi)、脂肪酸以及苯基乙基類(lèi)香氣化合物，且感官分析顯示混合發(fā)酵增強(qiáng)了酒樣的果香香氣特征。

葡萄中儲(chǔ)存的結(jié)合態(tài)香氣成分是葡萄酒中品種香氣的來(lái)源，在酒精發(fā)酵過(guò)程中結(jié)合態(tài)香氣成分通過(guò)相應(yīng)的糖苷酶水解，進(jìn)而釋放揮發(fā)性苷元，如C6-化合物、萜烯類(lèi)、C13-去甲類(lèi)異戊二烯等[29]。由于前期試驗(yàn)分析本株膠紅酵母對(duì)葡萄酒揮發(fā)性香氣成分以及感官特征的影響，因此本試驗(yàn)使用本株膠紅酵母與釀酒酵母混合酒精發(fā)酵，分析其混合酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，以及發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶的活性變化，以期揭示本株膠紅酵母影響葡萄酒品種香氣的潛在原因。酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果證明順序接種發(fā)酵葡萄酒的發(fā)酵速率更慢，因此發(fā)酵環(huán)境中的糖苷酶能發(fā)揮更久的糖苷水解活性。此外，在順序接種處理酒樣中，鼠李糖苷酶以及木糖苷酶在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)的高活性明確了混合接種對(duì)于提升糖苷酶活性的積極意義。本發(fā)酵試驗(yàn)中，各處理的酵母生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間較晚(第2～4天)，然而在1株優(yōu)選的葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究中，單一接種釀酒酵母和同時(shí)接種處理的酒樣在接種酵母后立即進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期[22]，其原因最可能源于其更高的發(fā)酵溫度。

目前，關(guān)于發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶活性變化的研究較少，Maturano等[30]監(jiān)測(cè)混合發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶的變化趨勢(shì)，結(jié)果表明發(fā)酵初期酶活較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酶活逐漸降低，并且在發(fā)酵中后期酶活幾乎為零，與本研究結(jié)果不同，其原因可能由于發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)度的差異(Maturano的試驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間為35 d)。此外，由于發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶活性并不是穩(wěn)定不變的，所以有必要觀(guān)察發(fā)酵過(guò)程中糖苷酶活性變化的規(guī)律，因此，Maturano等[31]在后期試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)了發(fā)酵過(guò)程中的β-葡萄糖苷酶的活性，但文章沒(méi)有直觀(guān)地表現(xiàn)酶活變化過(guò)程，反而僅列出了酶活變化曲線(xiàn)下方的積分面積來(lái)反映發(fā)酵過(guò)程中酶活總量。然而，本試驗(yàn)不僅給出了在混合發(fā)酵過(guò)程中不同糖苷酶活性變化的過(guò)程，而且利用累積酶活圖以期更加清楚地對(duì)比發(fā)酵過(guò)程中不同處理對(duì)4種糖苷酶活性的影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，膠紅酵母與釀酒酵母順序接種有助于減慢發(fā)酵速率，隨著接種釀酒酵母時(shí)間的推遲，膠紅酵母的生存時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，且最高生長(zhǎng)數(shù)量增多。所監(jiān)測(cè)的4種糖苷酶(β-葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶和木糖苷酶)主要在發(fā)酵前期表現(xiàn)較高的活性，混合接種發(fā)酵顯著提升鼠李糖苷酶、半乳糖苷酶和木糖苷酶活性的累積量，因此，膠紅酵母在與釀酒酵母混合發(fā)酵中有增香釀造的潛力，并且順序接種方案S48是最佳的接種方案。

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