HPLC法測定丁白貼劑成分含量的研究

張慧，張麗美，劉善新，蘇酩，李瑩，趙立建

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

漿細胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis)又稱為乳腺導管擴張癥，是以乳腺導管阻塞導致擴張、漿細胞受到浸潤為病變基礎的慢性非細菌性乳腺炎癥[1]。目前漿細胞性乳腺炎的治療方法主要包括西醫的手術切除法和中醫療法，中醫療法包括中藥內治法和外治法兩種，其中中藥外治法由于直接作用于病灶，見效快，副作用小，能夠徹底治愈等優點而具有明顯優勢。

丁白貼劑來源于臨床經驗總結方，具有溫通化瘀的功效，用于初期及中期漿細胞性乳腺炎的治療。貼劑由花椒(Zanthoxyli pericarpium)、丁香(Caryophylli flos)、赤芍(Paeoniae radix rubra)等中藥組成，對處方中的藥材經過提取純化，再以熱塑性壓敏膠為基礎膠黏劑，加入其他基質制成貼劑，使用方便，可隨時貼敷和停用，無創傷性，可持續給藥。丁香酚為丁香的主要成分，現代藥理學實驗表明，丁香酚具有消炎、鎮痛、增強免疫、抗腫瘤、促進透皮吸收等作用[2-3]。赤芍主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等[4]。具有清熱涼血，散瘀止痛的功效，現代臨床研究表明芍藥苷具有增強免疫功能、抗炎、鎮痛等作用[5]。為制定該制劑的質量標準，參考有關文獻[6-7]對其所含的丁香酚、芍藥苷進行了含量測定研究，并進行了方法學考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀；Ultimate 3000紫外檢測器，Chromeleon7工作站(美國Thermo公司)；色譜柱： Lichrospher C18柱(江蘇漢邦科技有限公司)；HH-4數顯電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇市晶玻廠)；Sartorius BP211D電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥

處方中赤芍等飲片購于山東百味堂中藥飲片有限公司，均為2015年版《中國藥典》一部[8]各藥材項下收載的正品飲片；芍藥苷對照品(批號110736-201438)、丁香酚對照品(110725-201615)均購自中國食品藥品檢定研究院；純凈水(杭州娃哈哈)；所用試劑甲醇、乙腈均為分析純或色譜純。

2 方法與結果

2.1 條件與制備

2.1.1 色譜條件

2.1.2 供試品溶液的制備

丁香酚：取本品膏體約2 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲(頻率40 kHz，功率300 W)30 min，放冷后稱重，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續濾液，以0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅰ。

芍藥苷：取本品膏體5 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷稱重，甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣加水20 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，水液用水飽和的正丁醇萃取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度搖勻，以0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液Ⅱ。

2.1.3 對照品溶液的制備

丁香酚：精密稱取丁香酚對照品，加甲醇配成濃度為47.2 μg·mL-1的溶液作為丁香酚對照品溶液。

芍藥苷：精密稱取芍藥苷對照品，加甲醇分別配制成濃度為27.3 μg·mL-1、54.6 μg·mL-1溶液作為對照品溶液。

2.1.4 空白對照溶液的制備

按處方比例，分別稱取除丁香、赤芍以外的其他藥材，模擬本品的制備工藝和供試品的制備方法，分別制成缺丁香空白對照溶液、缺赤芍空白對照溶液。

2.2 測試結果

2.2.1 空白干擾實驗

分別精密吸取丁香酚對照品溶液、供試品溶液Ⅰ、缺丁香空白對照溶液和濃度為27.3 μg·mL-1的芍藥苷對照液、供試品溶液Ⅱ、缺赤芍空白對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.2.1色譜條件檢測，結果表明丁香酚、芍藥苷對照液和供試品溶液在相同的保留時間均呈現吸收峰，而缺丁香、缺赤芍空白液在與對照品相應的位置上未見色譜峰出現，見圖1、圖2，這表明本測定無干擾。

圖1 丁香酚含量測定HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram for the determination of eugenol content

圖2 芍藥苷含量測定HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram for the determination of paeoniflorin content

2.2.2 線性關系考察

分別精密吸取丁香酚對照品溶液1、3、5、7、10 μL進樣測定，濃度為54.6 μg·mL-1的芍藥苷對照品溶液1、3、5、7、9 μL進樣測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，結果丁香酚線性范圍為0.0472～0.472 μg，回歸方程為：Y=14.52X-0.044，相關系數R=1.000 0；芍藥苷線性范圍為0.054 6～0.491 4 μg，回歸方程為Y=19.81X+0.079，相關系數R=0.999 9。

2.2.3 精密度

分別精密吸取丁香酚對照品溶液、芍藥苷對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，連續測定5次，測得丁香酚的峰面積積分值相對標準偏差為0.119%，芍藥苷的峰面積積分值相對標準偏差為0.448%。

2.2.4 穩定性

分別精密吸取丁香酚供試品溶液和芍藥苷供試品溶液各10 μL，在0，3，6，9，12，24 h 各進樣一次，共進樣測定6次，測其峰面積積分值，丁香酚相對標準偏差為0.197%，芍藥苷相對標準偏差為0.647%。

2.2.5 重復性考察

丁香酚：取同一批樣品(批號：20170206)約2 g，共取6份，精密稱定，按2.2.2項下供試品溶液Ⅰ方法制備供試液并測定丁香酚的含量，結果6次測定的丁香酚的平均含量為0.404 8 mg·g-1，其相對標準偏差為1.62%。

芍藥苷：精密稱取同一批(批號：20170206)樣品膏體5 g，平行操作6份，按2.2.2項下供試品溶液Ⅱ方法制備供試液并測定芍藥苷的含量，結果6次測定的芍藥苷平均含量為0.02681 mg·g-1，相對標準偏差為1.35%。

2.2.6 回收率

丁香酚：采用加樣回收法，精密稱取已測知丁香酚含量的同一批樣品(批號：20170206)約1 g，共6份，分別加入0.431 mg丁香酚混勻，制成供試品溶液，按2.2.1項下方法測定，結果丁香酚的平均回收率為97.18%，相對標準偏差為1.96%。

芍藥苷：采用加樣回收法，精密稱取已測知芍藥苷含量的同一批樣品(批號：20170206)膏體2.5 g，分別加入芍藥苷對照品0.068 mg，混勻，平行6份，制成供試品溶液測定，結果芍藥苷平均回收率為98.56%，相對標準偏差為1.24%。

2.2.7 樣品的測定

分別精密吸取丁香酚、芍藥苷對照品溶液與3批供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，并計算各批樣品中丁香酚、芍藥苷的含量，結果見表1。

表1 3批樣品含量測定結果(每貼含量)

3 討論

本貼劑的膏體較粘稠，在芍藥苷測定供試品溶液的制備中選用加熱回流提取法，將制劑中的有效成分提取更完全。對提取液純化時先用乙酸乙酯萃取除去脂溶性雜質，再以水飽和的正丁醇提取富集芍藥苷，經處理后的供試品溶液適宜于高效液相進樣分析。

本研究確定的丁白貼劑中丁香酚、芍藥苷的含量測定方法可行性、重復性好，可作為本制劑的含量測定方法，為制定可行可控的質量標準奠定了實驗基礎，同時也可以為同類制劑的含量測定提供參考。

參考文獻：

[1]唐潤薇.漿細胞性乳腺炎急性期切開引流術療效及術后切口愈合影響因素分析[J].河北醫藥,2016,38(23):3627-3629.

[2]彭宅彪，張瓊光，代虹健，等.丁香酚的藥理學研究進展[J].時珍國醫國藥,2006,17(10):2079-2081.

[3]王冬梅，李靜，徐月紅，等.寶瀉靈提取物的體外透皮吸收研究[J].中草藥,2007,38(10):1487-1490.

[4]吳修紅，孫曉蘭，胡妮娜，等.赤芍功效物質基礎研究進展[J].中醫藥信息，2017,34(2):120-122.

[5]陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學成分和藥理作用研究進展[J].中草藥,2015, 46(4):595-602.

[6]余小平.高效液相色譜法測定丁香中丁香酚的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(6):975-977.

[7]謝曉梅，余長柱，徐衡，等.赤芍飲片質量標準研究-芍藥苷的含量測定[J].中國中藥雜志,2004,29(8):759-762.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.