降鈣素原的原核表達及鑒定

蔣棚俊，吳勝昔，王玲玲，李令臣，李俊萱，曾 政，梁望旺，李 志

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2.重慶市動物疫病預防控制中心， 重慶 401120)

降鈣素原是由116個氨基酸組成的多肽，相對分子質量約為13 KD。它是一種糖蛋白，且無激素活性，其前肽物質是降鈣素[1-3]。大多數專家和學者都認為PCT可能是一種內源性非類固醇類抗炎物質[4-5]，正常人群體內的血漿PCT水平小于0.1 ng/mL[6]。患者在局部感染、病毒性感染時，血漿PCT水平一般不會發生變化。只有在患嚴重型全身性細菌感染、膿毒癥等疾病時患者體內的血漿PCT水平才會出現明顯上升。PCT的特異性較高，可應用于各種臨床癥狀的鑒別及診斷[7-8]。在患者體內血液中，PCT的半衰期為 25～30 h[9]，由此可見PCT的半衰期很短。1993年，PCT作為細菌感染的早期標志物在國外被首次報道[10]。目前PCT作為一個新的生物指標應用于檢測感染炎癥的程度,已廣泛運用于細菌性感染和膿毒癥的檢測。2001年，PCT作為一種診斷指標被國際膿毒癥會議指定在膿毒癥診斷中使用[11-13]。目前PCT被廣泛應用于臨床檢測以及指導抗生素用藥，但PCT檢測試劑均依賴進口，價格比較昂貴。PCT檢測試劑盒的關鍵試劑是能與PCT蛋白特異性結合的PCT單克隆抗體，但制備高效價、特異性強的抗體必須具有免疫原性強的PCT抗原，因為PCT在人血液含量極低且半衰期短，無法采用提取的方式獲得，而化學合成PCT蛋白價格非常昂貴，因此本研究擬采用基因工程方法表達PCT蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

所用大腸桿菌為BL21(DE3)、pET28a(+)質粒，重慶理工大學生物制藥實驗室保存；top10甘油菌、pET28a(+)/PCT重組質粒，購自上海生工生物有限公司，并測序。

1.2 實驗試劑

DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白質Marker，購自Thermo Scientific公司；HRP-羊抗小鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物有限公司；His-tag組氨酸單抗，購自美國Sigma公司。

1.3 pET28a(+)/PCT質粒的構建

通過NCBI查找PCT全基因序列，并對PCT基因序列進行優化，采用化學合成方法合成PCT基因，由上海生工進行測序。設計酶切位點(NcoI和XhoI)以及采用pET28a(+)作為表達載體。

1.4 重組蛋白的誘導表達

取少量top10甘油菌于LB液體培養基中(含卡那霉素)，搖床培養過夜，菌液采用質粒提取試劑盒提取PCT重組質粒并測定提取質粒的濃度。將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，重組感受態細胞接種于5 mL的LB液體培養基中，將各培養試管按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)和溫度梯度(16、25、37 ℃)以及時間梯度(6、8、10、12 h)進行PCT重組蛋白誘導表達，超聲破碎，離心，將離心所得的沉淀用適量的滅菌水溶解，煮樣，將樣品進行SDS-PAGE電泳分析確定PCT蛋白表達的最佳誘導條件。

1.5 重組蛋白的純化及鑒定

按優化得到的最佳條件大規模進行誘導表達重組蛋白，采用His-tag鎳柱純化重組PCT蛋白，收集純化所得產物，煮樣后進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.6 蛋白質印記(Western blot)分析

將誘導表達的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌3次；以His-tag組氨酸單抗為一抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次；以羊抗鼠IgG-HRP為二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加適量的化學發光液，紅外光掃描儀成像。

2 實驗結果與分析

2.1 重組載體的構建及鑒定

將重組質粒進行雙酶切(NcoI和XhoI)鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在362 bp處有一的特異性條帶，如圖1所示。由圖1可以得出：酶切DNA片段大小為362 bp，符合預期的結果。

M.DNA分子質量標準;1.pET28a-PCT的雙酶切產物

2.2 重組蛋白誘導表達條件的優化

2.2.1 重組蛋白誘導溫度的優化

在不同溫度(16，25，37 ℃)誘導所得產物進行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進行檢測，可見在17 kD有一條明顯的蛋白條帶，與預期大小相一致，說明pET28a(+)/PCT成功表達，如圖2所示。由圖2可以得出：25 ℃蛋白表達量較高，可作為后續誘導條件。

M.蛋白Marker; 3.空載體; 4.16 ℃誘導上清； 5.16 ℃誘導沉淀; 6.25 ℃誘導上清；7.25 ℃誘導沉淀; 8.37 ℃誘導上清； 9.37 ℃誘導沉淀

圖2 不同溫度誘導誘導表達產物

2.2.2 重組蛋白誘導劑量的優化

將25 ℃條件下，使用不同濃度IPTG(0.1、0.5、1 mmol/L IPTG)誘導PCT重組蛋白表達，所得產物進行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進行分析，結果如圖3所示。由圖3可以得出：在25 ℃條件下，IPTG濃度為0.5 mmol/L進行誘導，蛋白表達量最大。

M.蛋白Marker；1.空載體; 2. 0.1 mmol/L IPTG誘導上清; 3. 0.1 mmol/L IPTG誘導沉淀；4. 0.5 mmol/L IPTG誘導上清； 5. 0.5 mmol/L IPTG誘導沉淀； 6. 1 mmol/L IPTG誘導上清；7. 1 mmol/L IPTG誘導沉淀

圖3 25 ℃不同濃度IPTG誘導結果

2.2.3 重組蛋白誘導時間的優化

將25 ℃條件下，在不同時間(6、8、10、12 h)對0.5 mmol/L IPTG進行誘導，所得產物進行超聲破菌，沉淀用適量的滅菌水溶解，沉淀和上清用SDS-PAGE電泳進行檢測，結果如圖4所示。從圖4可以得出：在25 ℃條件下，IPTG濃度為0.5 mmol/L進行誘導12 h時，蛋白表達量最高。

1.空載體；M.蛋白Marker；3.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6 h誘導沉淀; 4.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 6h誘導上清；5. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h誘導沉淀; 6.25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 8 h誘導上清；7. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10h誘導沉淀; 8. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 10 h誘導上清；9. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h誘導沉淀；10. 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG 12 h誘導上清

圖4 25 ℃ 0.5 mmol/L IPTG不同誘導時間誘導表達產物

2.3 重組蛋白的純化及鑒定

2.3.1 重組蛋白的純化

利用重組蛋白攜帶的His-tag與Ni特異性結合的原理，采用不同濃度咪唑(50、100、200、300、400、500 mmol/L)進行梯度洗脫，收集洗脫下來的蛋白。

2.3.2 重組蛋白純化結果的鑒定

將純化所得的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結果如圖5所示。從圖5可以得出：100 mmol/L咪唑洗脫得到的蛋白相對分子質量大小為17 kD，與理論值相符合，100 mmol/L咪唑洗脫液可作為后續實驗洗脫濃度。

M.蛋白質Marker;1.空載體；2.流穿液；3.雜蛋白；5～7.100 mmol/L咪唑洗脫液

2.4 重組蛋白的蛋白質印記分析

將純化所得的蛋白進行SDS-PAGE電泳，再轉膜，使用抗His-tag組氨酸單抗作為一抗，對PCT重組蛋白進行Western blot分析，結果如圖6所示。由圖6可知：在17 kD處有明顯的蛋白印跡條帶，而空載體在對應位置無任何條帶，與預期結果相符合。通過Western blot可以看出，PCT重組蛋白的特異性較好。

1.純化所得PCT重組蛋白；2.空載體

3 結束語

近年來，降鈣素原在人體炎癥中的作用機理已廣泛引起了眾多專家和學者的重視，特別是在全身性炎癥反應、膿毒癥和細菌性感染領域。健康人體在感染炎癥后，患者體內的血漿PCT水平會在早期(2～3 h)發生迅速升高,因此PCT具有早期臨床診斷價值[14]。

PCT在血液中的半衰期較短，無法通過提取的方式大量獲得PCT蛋白，而通過化學方法合成PCT蛋白的成本過高，因此本文通過研究PCT的原核表達大量制備PCT蛋白具有重要意義。本研究選擇PET28a(+)為表達載體，在制定PCT全基因合成方案的時候，在N端引入一個His-tag，方便后續的純化工作。本研究使用成功構建的PET28a(+)/PCT重組質粒導入的top10甘油菌，提取PET28a(+)/PCT重組質粒，得到的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進行誘導表達。設置了不同溫度、不同誘導劑劑量、不同誘導時間優化PCT重組蛋白的誘導表達，篩選出的轉化后的PCT工程菌在25 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導12 h時蛋白表達量最大，可作為大批量誘導表達的條件。利用His-tag親和層析純化大批量誘導的PET28a(+)/PCT重組蛋白，收集純化得到的重組蛋白，采用SDS-PAGE電泳、Western blot分別對重組蛋白的純度及特異性進行了鑒定，電泳結果顯示：純化后的PCT重組蛋白有較高的純度，特異性良好。本研究獲得的重組PCT蛋白將為后續開展PCT單克隆抗體的制備以及檢測方法的研究提供良好的試劑。

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