尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續切片法

郭智俊，彭桂香

(廣東省人民醫院南海醫院/佛山市南海第二人民醫院病理科，廣東佛山 528251)

泌尿系腫瘤是我國常見的惡性腫瘤之一，尿脫落細胞檢查對泌尿系腫瘤的早期診斷、術后隨訪的意義已得到公認。常規的尿脫落細胞檢查采用涂片法，該方法無創、快速、操作簡易，在臨床工作中得到了廣泛應用。但常規涂片法細胞少而分散，細胞核易退變成毛玻璃狀；當標本含有大量血液時，涂片見成片的紅細胞，常常出現細胞堆積、重疊、厚薄不均勻，細胞結構及背景不清晰，細胞從玻片脫落等現象，往往導致癌細胞檢出率低。近年來，切片技術在胸腔積液、腹水和痰脫落細胞學中的應用，提高了制片質量，但未見尿脫落細胞切片的研究報道。筆者在實際工作中經過研究探索，設計了尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續切片法，克服了常規尿脫落細胞涂片法的缺點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器 采用普通水平式離心機，石蠟切片采用病理科的常規組織切片程序。

1.1.2試劑配制 (1)5%瓊脂：稱取瓊脂粉5 g置三角燒杯中，加蒸餾水100 mL加熱煮沸使瓊脂充分溶解，置65 ℃恒溫箱中，保持熔化狀態備用。(2)0.3%伊紅乙醇溶液：0.3 g伊紅加入95%乙醇溶液至100 mL。(3)10%醋酸乙醇溶液：10 mL冰醋酸加入95%乙醇溶液至100 mL。

1.2方法

1.2.1標本留取 為患者備好一個容量為500 mL 以上的潔凈尿瓶，加入10%醋酸乙醇溶液100 mL，并在其100 mL處作一標記，備用。將晨起第2次尿液排入上述備用的尿瓶內，或者囑患者在排空膀胱后，飲水500 mL左右，于1～2 h后收集第1次膀胱排空的尿液200～300 mL于上述備用的尿瓶中送病理科檢查。

1.2.2標本處理 將收到的尿液標本靜止沉淀30 min，慢慢倒掉尿液至100 mL標記處，并將此尿液分裝在兩個50 mL的離心管中，或者將尿液分裝在8個15 mL的離心管中，經1 800 r/min離心沉淀5 min，棄上清液；然后將沉淀物集中到一支試管內，經1 800 r/min離心沉淀5 min，棄上清液，取少量沉淀物做直接涂片2張，常規蘇木精-伊紅(HE)染色；再在剩余的沉淀物中加入0.3%伊紅乙醇溶液1～2 mL，以2 000 r/min離心8 min，吸去上清液，將保留管底沉淀物的試管置65 ℃恒溫箱中備用。

1.2.3沉淀物瓊脂石蠟雙包埋處理 將5%瓊脂從65 ℃恒溫箱中取出。同時從恒溫箱中取出保留管底沉淀物的試管，加入熔化的瓊脂1～3滴，放置冰箱待冷凝固成細胞團塊后取出細胞團塊，用刀片將其周圍的瓊脂切去。將細胞團塊放入已編號的包埋盒中，置脫水機常規脫水、透明、浸蠟，取出細胞團塊進行石蠟包埋。或者將細胞團塊放入已編號的包埋盒中進行人工脫水，步驟：(1)乙醇甲醛混合液(95%乙醇9份，濃甲醛1份)中30 min；(2)95%乙醇Ⅰ20 min；(3)95%乙醇Ⅱ30 min；(4)100%乙醇Ⅰ20 min；(5)100%乙醇Ⅱ30 min；(6)叔丁醇Ⅰ20 min；(7)叔丁醇Ⅱ30 min；(8)石蠟(熔點52 ℃)Ⅰ30 min；(9)石蠟(熔點58～60 ℃)Ⅱ30 min。以上各步驟均放置在62 ℃的恒溫箱中進行。取出細胞團塊進行石蠟包埋。

1.2.4連續切片和染色 蠟塊修整齊，越小越好，連續切片，沉淀物少的標本一次切完，不換刀，不移動刀片。切片應薄而均勻，切片厚度為3～4 μm，貼片時水溫要恰當，使蠟片伸展無皺折，將切片分別貼在普通載玻片和涂膠載玻片上，每張載玻片根據切片的大小按順序排列3～6排，其中第1～3片貼在普通載玻片上，第4～6片貼在涂膠載玻片上，按順序以此類推。普通載玻片按常規方法脫蠟、HE染色、封片；涂膠載玻片留做備用。

2 結 果

包埋好的蠟塊經過切片、HE染色后，鏡下細胞量明顯比常規涂片法豐富，細胞集中，厚薄均勻，結構清晰，核質對比好，色彩鮮艷明亮，部分可見組織結構，易于觀察診斷，見表1、圖1、2。

圖1 尿脫落細胞涂片法鏡檢(HE×200)

質量指標/方法涂片法切片法細胞數量較少較多鏡下觀察范圍觀察范圍大,費時觀察范圍小,省時細胞變形及退變 常見偶見

續表1 兩種方法制片質量比較

圖2 尿脫落細胞切片法鏡檢(HE×200)

3 討 論

尿路上皮分布廣泛，從腎盂、腎盞、輸尿管、膀胱直到尿道起始部。尿路上皮細胞癌是繼前列腺/乳腺癌、肺癌和結直腸癌后第4種最常見的腫瘤類型[1]。尿路上皮細胞癌中膀胱癌最常見，占所有尿路上皮細胞癌的90%～95%[2]。膀胱癌的發病率和病死率在泌尿系統疾病中均居首位[3]。雖然其惡性程度低，但復發率較高[4]，一旦發生侵襲或轉移預后極差[5]。因此，早期發現并給予積極治療是提高臨床治愈率的關鍵[6-8]。目前膀胱癌的診斷主要以膀胱鏡、尿脫落細胞學和熒光原位雜交技術(FISH)為主，然而三者都存在一定缺陷[9-10]，膀胱鏡檢查是目前術前診斷和術后隨訪的“金標準”，膀胱鏡雖然在檢查過程中能夠很好地直觀病灶及取樣活檢，但是膀胱鏡是有創檢查，患者往往很抵觸這種昂貴、痛苦的侵入性檢查，在臨床應用中受到了很大的制約；同時，膀胱鏡由于觀察范圍有限并依賴操作者的經驗，可能會遺漏位于膀胱前壁和腎小盞等難以窺視部位的腫瘤，另外一些平坦型病變或原位癌也是膀胱鏡檢查的盲區[11]。FISH診斷膀胱癌的特異性與常規尿脫落細胞相當，且敏感性大大提高，優于尿脫落細胞檢查，有研究表明該檢測有著較高的靈敏度(70%～96%)及特異度(65%～96%)[12-14]。但是，FISH檢測費用昂貴，在一定程度上增加了患者的經濟負擔，同時其所需設備及技術要求高、操作流程復雜，大范圍普及有一定的難度。超聲、X射線、CT和磁共振成像(MRI)影像學檢查，雖然整個尿路的情況能夠顯示出來，但對于血尿患者中常見的占位性病變如血凝塊、炎性包塊和腫瘤不易鑒別，常常不能明確病灶的性質。

尿液脫落細胞學檢查是臨床泌尿系腫瘤的有效篩查手段[15-16]。尿脫落細胞學檢測膀胱癌的靈敏度為13%～75%，特異度為85%～100%，其特異度不但是目前無創診斷指標中最高的，而且也得到了美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南作為無創診斷指標的惟一推薦。其在原位癌的診斷中具有較高價值[17]。尿脫落細胞學檢查不受腫瘤部位的限制，即使在發病早期由于腫瘤細胞代謝旺盛仍可有較多的癌細胞從病灶表面脫落，可以通過細胞學的方法早期發現及診斷。尿脫落細胞學檢查方法簡便，可反復多次檢查，且可以發現膀胱鏡檢查不易觀察到的特殊部位腫瘤，對患者無損傷，安全、經濟、特異性較高，容易被患者接受，因此在基層醫院廣泛應用。但尿脫落細胞涂片檢查的缺點是靈敏度低[18]。尿脫落細胞涂片檢查靈敏度低的原因是：(1)傳統的留尿方法是每天留取早晨第2次尿的中段尿10 mL，由于只留取10 mL中段尿，常常導致離心后無沉淀物，涂片鏡下細胞成分少或看不到細胞成分，從而影響尿脫落細胞檢出率；此外，在送病理科之前未對尿液標本進行處理，細胞成分易被變性。(2)常規尿液涂片法涂片范圍大，鏡下細胞分散、觀察費時，易漏診。(3)涂片細胞固定較困難，如果用濕固定法，直接將玻片放入95%乙醇內固定，會造成大多數細胞脫落，造成漏診，導致出現假陰性；如果干燥后再固定，細胞會發生退變，細胞核模糊不清，造成誤診，導致出現假陽性。(4)當尿液中有較多細胞時，特別是血尿患者有大量紅細胞時，常規涂片鏡下細胞出現堆積重疊現象，造成診斷困難。為了克服涂片法的不足，筆者設計了尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續切片法，該方法收集晨起的第2次全部尿液，收集尿液更多，陽性率更高。同時，由于在留取尿液標本中加入了10%醋酸乙醇溶液，細胞在液體中立即固定，避免常規涂片后空氣干燥造成的細胞退變，保持了原有的細胞形態結構；其中的醋酸也能溶解過多的紅細胞，既避免紅細胞遮擋、細胞重疊，又節省了閱片時間，減少了漏診，提高了工作效率。標本離心處理過程中加入0.3%伊紅乙醇溶液，使沉淀物著色，便于在包埋、切片和漂片時辨認。瓊脂是一種從海藻類石花菜中提取的多分支的復雜多糖，具有三維空間網狀多孔性結構，瓊脂溶解度為90 ℃，凝固度為40 ℃。同時，瓊脂易溶于水，在室溫下幾分鐘就能凝固。瓊脂具有凝固性、穩定性、支持性和耐切割性，在浸蠟的溫度下仍為固態。由于固態瓊脂含有網狀孔隙，所以在脫水、透明、浸蠟的過程中乙醇、二甲苯或叔丁醇和石蠟都可通過瓊脂滲透到組織細胞中，不影響組織細胞的脫水、透明和浸蠟。瓊脂的濃度不能太高，低濃度的瓊脂更有利于脫水劑、透明劑和石蠟的滲透；但濃度也不可太低，以保持其形狀完整，不易碎裂為宜。本文使用5%瓊脂達到了良好的效果。尿脫落細胞用瓊脂包埋后，在脫水、透明、浸蠟的過程中既可以避免細胞及碎小組織丟失及其他細胞、碎小組織的混入，又可克服尿脫落細胞沉淀物太小所造成的包埋困難。用該方法幾乎能收集尿液中的所有細胞，制成的蠟塊進行連續切片，各細胞及碎小組織可以完整切出，防止由于切片不完全所造成的漏診。同時，筆者采取的貼片方法有利于切片連續不亂，整齊排列，每張載玻片可多貼切片，既節省載玻片又有利于顯微鏡下觀察。制出的切片鏡下細胞量明顯比常規離心涂片法豐富，切片觀察范圍比涂片小，觀察省時，細胞無重疊，厚薄一致，細胞結構及背景清晰，部分可見組織結構；HE染色核質對比好，色彩鮮艷明亮，可提高尿脫落陽性細胞的檢出率。同時，蠟塊便于長期保存及進行免疫細胞化學等檢測。

綜上所述，尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續切片法克服了常規涂片法的不足，設備簡單，操作簡便，費用低廉，在尿路上皮癌的診斷和術后監測上具有重要的臨床意義,值得普及推廣應用，尤其是可以作為基層醫院的常規篩查方法。同時，筆者目前正在研究應用尿脫落細胞涂片法和尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續切片法進行對比觀察并進行免疫細胞化學等檢測，進一步尋找早期診斷膀胱癌的特異度和靈敏度更高的診斷指標，從而降低假陽性率和假陰性率。

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