睪丸轉(zhuǎn)染miR-383對(duì)KM小鼠精子凋亡的影響*

董涵 侯開領(lǐng) 周靜 袁明銘 夏介英 洪楊 張磊

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四川 成都 610041)

由于環(huán)境污染加重、人們工作和精神壓力增大等因素，人類不孕不育率顯著增加。研究表明每6對(duì)夫妻就有1對(duì)不育，其中由男方因素引起的約占50%[1]。大量研究表明，miRNAs在生物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和凋亡等過程中起著重要的調(diào)控作用，miRNAs也調(diào)控著睪丸的正常發(fā)育和精子生成過程[2-3]。Lian等[4-5]發(fā)現(xiàn)miRNA-383在成熟停滯型男性不育(maturation arrest，MA)患者和非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia, NOA)患者的睪丸樣品中明顯下調(diào)。目前國內(nèi)外對(duì)miRNA-383研究報(bào)道相對(duì)較少，已有的研究主要集中在不育癥患者體內(nèi)的表達(dá)情況和相關(guān)作用機(jī)制以及與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[4-7]上。無直接在小鼠睪丸上轉(zhuǎn)染miRNA-383以觀察其對(duì)精子凋亡影響的，也沒有研究嘗試?yán)胢iRNA-383對(duì)健康動(dòng)物的繁殖能力進(jìn)行干預(yù)的。

本研究通過監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染后雄鼠生活狀態(tài)，以及檢查部分器官病理變化和部分血液生化指標(biāo)來觀察其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響，為建立完善的活體動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染技術(shù)平臺(tái)，繼而進(jìn)一步利用miRNAs數(shù)據(jù)庫建立各種動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠64只雌雄各半，10 周齡，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK川 2013-19，使用許可證號(hào):SYXK 川 2013-100)。若干只10 周齡SPF級(jí)KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌雄按照1:1比例隨機(jī)組成家庭，選取第一胎產(chǎn)子數(shù)為10只左右的32個(gè)家庭，隨機(jī)分成4組，分別標(biāo)記為：①miRNA-383過表達(dá)組。②miRNA-383抑制組。③轉(zhuǎn)染對(duì)照組。④空白對(duì)照組，每組8個(gè)家庭。

1.1.2 主要試劑 Mum-mimic-miRNA-383、inhibitormiRNA-383，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；EntransterTM- in vivo(動(dòng)物體內(nèi)RNA轉(zhuǎn)染試劑)，購自北京英格恩生物科技有限公司，批號(hào)18668-11-1；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，購自 TaKaRa，批號(hào)9767-AK901；TaqManTMMicroRNA Assays Data Sheet、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit，均購自Applied Biosystems；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，購自BD；HEPES，購自SIGMA。孵育緩沖液：10mmol/L HEPES、140mmol/L NaCl、2.5mmol/L CaCl2、pH=7.4。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜，購自AIRTECH，型號(hào)BSS-130011A2；離心機(jī)，Thermo，LEGEND MICRO 17R；熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Step One；流式細(xì)胞儀，beckman，F(xiàn)C500；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，ML203/02；微量進(jìn)樣器，上海安亭微量進(jìn)樣器廠，MC10uL；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療，HH·BII·420-BS-Ⅱ；Venus鑷。

1.2 方法

1.2.1 睪丸轉(zhuǎn)染與觀察記錄 miRNA稀釋：將含有1OD Mum-mimic-miRNA-383和inhibitormiRNA-383干粉的EP管用10μlDEPC水稀釋，稀釋后miRNA濃度約為3.3μg/μl。各組KM小鼠家庭在雌鼠第一胎產(chǎn)子前雌雄分開，最后一只雌鼠產(chǎn)子后5d定義為第0d，然后分別在第1、4、7d對(duì)①～④組雄鼠進(jìn)行睪丸轉(zhuǎn)染，每支睪丸注射轉(zhuǎn)染混合物10μl，不同組別轉(zhuǎn)染混合物構(gòu)成(見表1)。第1d完成注射后12h再次將4組雄鼠與原配偶合籠，第10d將雄鼠取出用于采樣及后續(xù)步驟。期間每天對(duì)雄鼠進(jìn)行觀察、稱重。雌鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，直至第二胎出生，記錄產(chǎn)子數(shù)后脫頸處死。

表1 不同組別轉(zhuǎn)染混合物構(gòu)成情況 Table 1 Composition of transfected mixture in different groups

注：表內(nèi)混合物劑量是每支睪丸用量；每組轉(zhuǎn)染混合物充分混合后室溫靜置15分鐘

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取樣與內(nèi)臟病理切片檢測(cè) 解剖取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。肝、腎、腎上腺和睪丸放入福爾馬林溶液中固定1周，常規(guī)石蠟包埋，切片備用，HE染色，光鏡觀察。

1.2.3 熒光定量檢測(cè) 每組隨機(jī)選兩只雄鼠用于熒光定量檢測(cè)，每只雄鼠取1支睪丸。用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA，然后利用TaqManTMMicroRNA Assays Data Sheet、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ完成對(duì)Mum-miRNA-383和內(nèi)參基因U6的反轉(zhuǎn)錄和熒光定量。

1.2.4 精子凋亡率檢測(cè) 雙側(cè)附睪置于潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，事先放入孵育緩沖液。剪刀剪破附睪管并用Venus鑷擠出精子團(tuán)，經(jīng)四層擦鏡紙過濾去除雜質(zhì)，獲得精子懸液。取1×106個(gè)精子細(xì)胞于試管中，1500rpm離心5分鐘，小心棄去液體，加4℃ PBS洗滌3次利用Annexin V-FITC/PI雙染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子凋亡情況。

1.2.5 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 雄鼠用摘眼球法取血，然后脫頸處死，血液1500rpm離心5分鐘，取血清檢測(cè)與肝功、腎功密切相關(guān)的ALTL(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、ASTL(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、CREA(肌酐)、UREAL(尿素)以及UA2(尿酸)的含量。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量結(jié)果 不論與空白對(duì)照組還是轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比(定義空白對(duì)照組Mum-miRRNA-383表達(dá)量為1)，miRNA-383過表達(dá)組平均表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，miRNA-383抑制組顯著降低(P<0.01)，其中miRNA-383過表達(dá)組平均表達(dá)量是轉(zhuǎn)染對(duì)照組的16.89倍，而轉(zhuǎn)染對(duì)照組又是miRNA-383抑制組的15.75倍。而空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組之間表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。說明各組睪丸成功轉(zhuǎn)染miRNA-383，其在miRNA-383過表達(dá)組中被高表達(dá)，在miRNA-383抑制組中被抑制表達(dá)，見圖1。

圖1 各組Mum-miRNA-383相對(duì)表達(dá)量 Figure 1 Relative expression of Mum miRNA 383 in each group注：與空白對(duì)照組比較，①P<0.05

2.2 睪丸轉(zhuǎn)染miRNA-383對(duì)雄性KM小鼠產(chǎn)子數(shù)的影響 各組在進(jìn)行睪丸轉(zhuǎn)染后平均產(chǎn)子數(shù)都與轉(zhuǎn)染前有不同程度的下降，其中miRNA-383抑制組下降最多，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miRNA-383過表達(dá)組下降最少，并與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比有增加趨勢(shì)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染前后各組產(chǎn)子數(shù) Table 2 The number of output number before and after transfection

注：與空白對(duì)照組比較，①P<0.05

2.3 睪丸轉(zhuǎn)染miRNA-383對(duì)雄性KM小鼠精子凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子凋亡。miRNA-383過表達(dá)組精子凋亡率平均數(shù)為(10.60±3.27)%，miRNA-383抑制組為(919.28±3.06)%，轉(zhuǎn)染對(duì)照組為(15.15±1.34)%，空白對(duì)照組為(7.20±0.71)%。從結(jié)果可以看出與空白對(duì)照組相比，miRNA-383過表達(dá)組、miRNA-383抑制組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組精子凋亡率平均數(shù)均有增加的趨勢(shì)，其中miRNA-383過表達(dá)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miRNA-383抑制組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，miRNA-383過表達(dá)組凋亡率下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miRNA-383抑制組凋亡率增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明轉(zhuǎn)染試劑對(duì)精子有一定毒性，能增加精子凋亡率，但miRNA-383過表達(dá)能一定程度對(duì)抗該影響，起到抑制精子凋亡的作用，抑制miRNA-383的表達(dá)能加劇精子凋亡。

2.4 雄性KM小鼠生活狀態(tài)與體重變化情況 各組雄性小鼠無論在睪丸轉(zhuǎn)染前還是后均活潑好動(dòng)、正常采食飲水和自由梳理毛發(fā)，主動(dòng)與雌性相互聞嗅舔舐追逐，并且具有正常的交配行為。睪丸轉(zhuǎn)染期間雄性KM小鼠體重變化情況，每組平均體重均根據(jù)該組給藥前體重進(jìn)行校正。從圖中可以看出各組在給藥后平均體重都出現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)，其中miRNA-383過表達(dá)組校正后平均體重在給藥第4～9d與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第8d和9d與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.5 內(nèi)臟病理切片檢測(cè)結(jié)果 KM小鼠肝、腎、腎上腺和睪丸病理組織切片結(jié)果，見圖3。

圖2轉(zhuǎn)染期間雄性KM小鼠體重變化情況Figure2WeightchangesofmaleKMmiceduringtransfection

圖3 病理組織學(xué)HE染色顯示(400×) Figure 3 Histopathologoical HE stacining

注：圖①、②、③、④分別為miR383過表達(dá)組、miR383抑制組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組肝臟組織切片圖，各組未見明顯異常；圖⑤、⑥、⑦、⑧分別為miR383過表達(dá)組、miR383抑制組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組腎臟組織切片圖，miRNA-383過表達(dá)組和空白對(duì)照組未見明顯異常；miRNA-383抑制組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組觀察到輕微腎間質(zhì)血管周圍炎；圖⑨、⑩、、分別為miR383過表達(dá)組、miR383抑制組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組腎上腺組織切片圖，miRNA-383過表達(dá)組腎上腺內(nèi)細(xì)胞壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其余各組未見明顯異常；圖、、、分別為miR383過表達(dá)組、miR383抑制組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組睪丸組織切片圖，miRNA-383過表達(dá)組、miRNA-383抑制組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組都發(fā)現(xiàn)一定程度的精曲小管急性壞死，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生；空白對(duì)照組未見明顯異常

2.6 小鼠血液生化指標(biāo) 轉(zhuǎn)染對(duì)照組ALTL含量高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miRNA-383過表達(dá)組和miRNA-383抑制組UA2含量均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而miRNA-383過表達(dá)組和miRNA-383抑制組與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.7 小鼠主要臟器指數(shù) 與空白對(duì)照組相比，miRNA-383過表達(dá)組腎上腺指數(shù)偏低且差異極顯著(P<0.01)；轉(zhuǎn)染對(duì)照組心臟指數(shù)偏高且差異顯著(P<0.05)。與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，miRNA-383抑制組肺臟指數(shù)和腎臟指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明降低睪丸中miRNA-383表達(dá)量可能對(duì)小鼠肺臟和腎臟有一定影響，見表4。

表3 各組血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 Table 3 Biochemical indexes of blood in each group

注：與空白對(duì)照組比較，①P<0.05

表4 內(nèi)臟指數(shù) Table 4 Visceral index

注：與空白對(duì)照組比較，①P<0.05;與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，②P<0.05

3 討論

精子發(fā)生過程中，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控非常活躍，介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制在有序調(diào)控基因表達(dá)中扮演重要角色。對(duì)基因表達(dá)的精確時(shí)空調(diào)控是精子發(fā)生正常進(jìn)行的根本條件，這種調(diào)控主要是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學(xué)水平上的[8]。所以對(duì)于繁殖相關(guān)microRNA調(diào)控機(jī)制的深入研究以及如何開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。Lian等[4-5]發(fā)現(xiàn)miRNA-383的上調(diào)和IRF1的下調(diào)與MA型男性不育患者的生精細(xì)胞有絲分裂活性相關(guān)，并且miR-383-IRF1-pRb通路與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞NT-2的存活關(guān)聯(lián)，總之miRNA-383抑制以IRF1為靶向的系列細(xì)胞周期相關(guān)基因。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)正常男性miRNA-383主要表達(dá)于精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，在精子中表達(dá)較少。miRNA-383能誘導(dǎo)γH2AX的下降，參與到DNA損傷通路的調(diào)控。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，增加雄鼠睪丸內(nèi)miRNA-383表達(dá)量能顯著降低精子凋亡率，產(chǎn)子數(shù)有增加趨勢(shì)；抑制miRNA-383的表達(dá)量精子凋亡率則顯著增加，產(chǎn)子數(shù)有降低趨勢(shì)。該結(jié)果與Lian等[4,5]有同一性，但角度不同。這說明miRNA-383對(duì)雄鼠繁殖力起重要的正向調(diào)控作用，過表達(dá)miRNA-383能促進(jìn)其繁殖力，而睪丸中缺乏miRNA-383能降低繁殖力。同時(shí)該結(jié)果還提示能夠通過睪丸轉(zhuǎn)染的方式，利用miRNAs對(duì)雄鼠繁殖力進(jìn)行干預(yù)，為進(jìn)一步制作不育動(dòng)物模型或者不孕癥治療研究提供基礎(chǔ)。

與空白對(duì)照組相比，其余三組精子凋亡率都升高，產(chǎn)子數(shù)都有下降趨勢(shì)，睪丸內(nèi)部組織也都出現(xiàn)了一定程度損傷。說明轉(zhuǎn)染試劑本身對(duì)小鼠睪丸有一定毒性。本文轉(zhuǎn)染條件源于試劑說明書的推薦，但能否通過進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑用量以及miRNA用量來減小局部轉(zhuǎn)染對(duì)組織的毒性有待進(jìn)一步研究。

活體基因局部轉(zhuǎn)染排除了傳統(tǒng)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因不穩(wěn)定、影響因素過多等多種弊端，試驗(yàn)效果能更直接反應(yīng)目的基因?qū)Π袠?biāo)組織的影響，具有直觀方便等多種優(yōu)點(diǎn)，在分子醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到廣泛應(yīng)用[10-12]。miRNA-383非睪丸特異性microRNA，已有大量研究表明其對(duì)多種組織功能的發(fā)揮以及腫瘤細(xì)胞的生成和凋亡其重要調(diào)控作用[13-15]，本文采取睪丸局部轉(zhuǎn)染的方式最大程度降低其對(duì)其它組織、其它系統(tǒng)的影響。miRNA-383過表達(dá)組8d和9d校正后平均體重比轉(zhuǎn)染對(duì)照組顯著下降，腎上腺有一定程度異常；miRNA-383抑制表達(dá)組，腎臟觀察到一定程度異常，肺臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與轉(zhuǎn)染對(duì)照組差異顯著。說明睪丸轉(zhuǎn)染miRNA-383對(duì)健康KM小鼠正常機(jī)體有一定影響，而該影響具體發(fā)生機(jī)制和對(duì)機(jī)體影響程度有待進(jìn)一步研究。但轉(zhuǎn)染前后4組小鼠生理生活、行為習(xí)慣等表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)死亡、器官衰竭等其它嚴(yán)重病癥，表明該操作對(duì)小鼠機(jī)體總體影響不大。對(duì)比利用多種常見方法制作睪丸性不育小鼠模型后小鼠機(jī)體狀態(tài)[18-19]，可以看出該操作對(duì)小鼠正常機(jī)體影響較小。

4 結(jié)論

健康可育小鼠睪丸內(nèi)miRNA-383表達(dá)量增加能顯著降低精子凋亡率，反之則增加。miRNA-383對(duì)雄鼠繁殖力起重要的正調(diào)控作用，通過睪丸轉(zhuǎn)染有望對(duì)雄鼠繁殖力進(jìn)行人為干預(yù)。

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