以魔芋多糖為碳源的產聚羥基丁酸酯菌的篩選、鑒定及發酵研究

李凌凌，毛 偉，張家銘，黃 皓，左振宇，楊忠華

(1.武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢，430081；2. 武漢科技大學煤轉化與新型炭材料湖北省重點實驗室，湖北 武漢，430081)

魔芋多糖(又稱魔芋葡甘露聚糖)的主要成分是甘露糖和葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵連接起來的線性高分子化合物[1]，可作為底物誘導微生物生產β-1,4-D-甘露聚糖酶(即β-甘露聚糖酶)[2]，并在酶的作用下分解成能被人體吸收利用的魔芋低聚糖。魔芋低聚糖能有效改善腸道內菌群結構，還可用于治療高血脂癥、預防動脈硬化和冠心病的發生[3-4]。考慮到β-甘露聚糖酶為胞外水解酶，以魔芋多糖為碳源培養的微生物發酵液經離心處理獲得含魔芋低聚糖的上清液后，會產生大量的菌體沉淀，如何利用這些菌體廢棄物開發具有應用前景的產品是一個重要的研究課題。

聚羥基烷酸酯(PHAs)作為一類由微生物合成的細胞內聚酯，是胞內積累的碳源和能源儲存物，其典型代表為聚羥基丁酸酯(PHBs)。PHB具有生物降解性、熱塑性和生物相容性，并且無毒，被認為是石油化學聚合物的替代品[5-6]。但是，與石油化工材料相比，利用微生物發酵法生產PHB的成本很高，嚴重制約了其大規模生產和應用。研究表明，采用廉價碳源(如食品廢棄物[7]、粗甘油[8-9]、半纖維素水解液[9]、廢菜籽油[10]、皂化廢棕櫚油[11]等)培養微生物，可以使PHB的生產成本降低。目前已報道的能夠積累PHB的微生物種類雖然不少，但仍然有許多潛在的聚羥基丁酸酯生產菌未被發現，另外，不同微生物積累PHB所需的碳源也不盡相同[7,9]，因此，很多學者一直致力于從各種環境中分離獲得可以利用廉價碳源合成PHB的新型細菌，從而將微生物發酵法應用到PHB工業化生產中。

我國的花魔芋和白魔芋資源豐富[1]，可以為微生物發酵生產PHB提供大量廉價的魔芋多糖作為碳源。本研究擬篩選以魔芋多糖為碳源在細胞內合成聚羥基丁酸酯的菌株，達到降低PHB生產成本的目的，并且同時獲得魔芋低聚糖和生物降解材料PHB兩種高附加值產品。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

富集培養基：魔芋精粉2.0 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，加蒸餾水定容至100 mL，用于富集培養可產β-甘露聚糖酶的細菌。

固體分離培養基：魔芋精粉1.0g，NaNO30.3g，K2HPO40.1g，KCl 0.05g，MgSO40.05g，FeSO40.05 g，瓊脂1.8 g，加蒸餾水定容至100 mL，用于分離純化可產β-甘露聚糖酶的細菌。

LB培養基：按照文獻[12]配制，用于觀察細菌的菌落特征、液體培養特征、運動性及與氧氣的關系。

修正的M9培養基：Na2HPO40.678 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 1.8 g，CaCl20.001 g，MgSO4·7H2O 0.0492 g，葡萄糖0.786 g，加蒸餾水定容至100 mL，pH調至7.0，用于優化菌體的聚羥基丁酸酯生產條件。

1.1.2 酶和化學試劑

pMD18-T載體連接試劑盒為大連寶生物工程有限公司產品；通用型柱式基因組DNA提取試劑盒、高純度質粒小提試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞和2×ES Taq MasterMix(含染料)為康為世紀生物科技有限公司產品；PCR產物純化回收試劑盒(Cycle-pure kit)為美國OMEGA公司產品；引物合成和測序工作由武漢擎科創新生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 以魔芋多糖為碳源合成PHB的菌株篩選

(1)菌株的富集及分離純化

取云南種植魔芋的農田土壤樣品1 g加到100 mL富集培養基中，在30 ℃、150 r/min的恒溫搖床中培養24 h。取1 mL富集培養的菌液稀釋涂布到固體分離培養基上，30 ℃培養24 h。挑取菌落在固體分離培養基上劃線，待菌苔生成后鏡檢，如果菌體不純，則繼續劃線純化培養，直至鏡檢下出現單一形態的菌體。

(2)菌株的篩選

挑取純化后的單菌落點接到固體分離培養基上，待菌落生成后，用剛果紅溶液染色0.5 h，再用生理鹽水洗去剛果紅染液，觀察菌落周圍有無透明圈，作為菌株產β-甘露聚糖酶能力的初步檢測標準[13]。選擇透明圈大的菌株，檢測其合成PHB的能力：細菌經蘇丹黑染色后在光學顯微鏡下觀察，若視野中60%的細菌內有藍黑色顆粒，則為產PHB的菌株[14]，命名為LKH。

1.2.2 以魔芋多糖為碳源合成PHB的菌株鑒定

(1)菌株個體形態觀察和生理生化特征鑒定

革蘭氏染色及芽孢染色、細菌的生理生化特征鑒定均參照文獻[12]。

(2)菌株最適生長溫度和pH值的確定

為了研究溫度對菌株生長的影響，以10%的接種量接種處于對數期的菌株LKH到一組修正的M9液體培養基中，分別置于25、28、30、37、40 ℃的恒溫搖床(200 r/min)中振蕩培養24 h，檢測培養液的OD600值。另外，以10%的接種量接種處于對數期的菌株到一組pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的修正的M9液體培養基中，置于30 ℃恒溫搖床(200 r/min)中振蕩培養24 h，檢測培養液的OD600值，以研究培養基的pH值對菌株生長的影響。

(3)系統發育樹的構建

按照通用型柱式基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株LKH的基因組DNA。使用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應體系：菌體LKH的基因組DNA 1 μL，2×ES Taq MasterMix(含染料)12.5 μL，引物27F(20 μmol/L)1 μL，引物1492R(20 μmol/L)1 μL，無菌水補至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，之后按如下程序(95 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)進行35個循環，最后一個循環72 ℃延伸10 min。根據pMD18-T載體連接試劑盒說明書，將菌株LKH的16S rDNA的PCR擴增產物連接到pMD18-T載體上，構建重組載體pMD-LKH。重組質粒的測序結果提交到NCBI數據庫進行Blast比對，利用EBI數據庫中的Clustal Omega功能進行多重序列比對，使用軟件MEGA 5.0構建系統發育樹，其中根據maximum composite likelihood model計算進化距離，采用neighbor-joining statistical method構建進化樹。

1.2.3 生長曲線的繪制

取1 mL處于對數期的菌株接種到100 mL修正的M9液體培養基中，在30 ℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養。每隔一定時間取樣，測定菌液的OD600值。試驗設置3個平行組，取平均值繪制菌液的OD600隨時間的變化曲線(即生長曲線)。

1.2.4 PHB發酵條件的優化

(1)PHB的提取及分析方法

采用氯仿-次氯酸鹽法提取PHB[15]，參照文獻[16]計算PHB的含量和提取率。將PHB標準樣品和從菌株LKH中提取并純化的白色薄膜樣品經甲酯化后進行氣相色譜分析[16]，同時兩類樣品用KBr壓片后進行紅外光譜檢測[17]。

(2)碳源的優化

取1 mL處于對數期的菌株接種到100 mL添加相同質量碳源(分別為花生油、亞油酸、亞麻酸、油酸、纖維素、魔芋精粉、葡萄糖)的修正的M9液體培養基中，在30 ℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養4天，提取PHB，測定其含量(即PHB的純度)，計算PHB提取率。

(3)氮源濃度的優化

以魔芋精粉為碳源物質，配制分別含有0.1、0.2、1、5、10、20 g/L氮源NH4Cl的修正的M9液體培養基。取1 mL處于對數期的菌株接種到100 mL上述培養基中，在30 ℃、200 r/min的恒溫搖床中振蕩培養4天，提取PHB，測定其含量，計算PHB提取率。

2 結果與分析

2.1 產聚羥基丁酸酯菌LKH的篩選

挑取固體分離培養基上剛果紅染色水解圈較大的菌株(見圖1(a))進行蘇丹黑染色(見圖1(b))，結果呈陽性，且胞內的藍黑色顆粒較多，初步推斷該菌能夠分泌β-甘露聚糖酶，水解魔芋精粉以提供生長所需的碳源，同時在胞內合成PHB。

(a)剛果紅染色的水解圈

(b)蘇丹黑染色

2.2 產聚羥基丁酸酯菌LKH的鑒定

2.2.1 菌株LKH的個體形態特征

在光學顯微鏡下，菌株LKH呈桿狀，可游動、旋轉，革蘭氏染色為紫色，呈陽性，芽孢染色為綠色，呈陽性，芽孢形態為橢圓形。

2.2.2 菌株LKH的群體形態特征

菌株LKH在LB固體培養基上生長24 h后長出的菌落為乳白色，圓形，不透明，表面光滑濕潤，黏度較大，邊緣整齊且中間隆起(見圖2a)。菌株LKH在LB半固體培養基的穿刺試驗結果如圖2(b)所示，菌體在穿刺部位的四周呈云霧狀生長，推斷菌株LKH兼性好氧，可運動。

(a)菌落特征 (b)穿刺試驗結果

圖2菌株LKH的形態特征

Fig.2MorphologicalcharacteristicsofStrainLKH

2.2.3 菌株LKH的最適生長溫度和pH值

溫度和培養基pH值對菌株LKH生長的影響如圖3所示。由圖可見，在25～40 ℃的溫度范圍內，菌株LKH在修正的M9液體培養基中都可以較好地生長，其中在28 ℃下生長得最好。另外，當培養基pH值低至4.0時，菌株LKH不能正常生長，而在pH 值為6.0～8.0的范圍內，菌株在修正的M9液體培養基中都可以很好地生長，其中菌株LKH的最適生長pH值約為7.0，此時生物量最大。

(a)溫度

(b)培養基pH值

Fig.3EffectsoftemperatureandpHofculturemediumonthegrowthofStrainLKH

2.2.4 菌株LKH的生理生化特征

菌株LKH的生理生化特征如表1所示，為了便于后續的對比分析，表1中同時列出了菌株NRRL NRS-1356[18]和菌株M17[19]的生理生化特征。由表1可見，菌株LKH的接觸酶反應為陽性，氧化酶反應為陰性，可以向胞外分泌淀粉酶、脂肪酶和脲酶，能夠液化明膠。菌株LKH的IMViC試驗結果分別為：Voges-Proskauer(V-P)反應為陽性，即細菌可以發酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇；檸檬酸試驗呈陽性反應，即可以利用檸檬酸鹽產生堿性碳酸鹽，使培養基pH值升高從而變成藍色；但菌株LKH的甲基紅反應呈陰性，且不可產生色氨酸酶分解色氨酸產生吲哚。菌株LKH不能水解培養基中的含硫氨基酸生成H2S，也不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在糖發酵試驗中，菌株LKH可利用木糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖產酸和少量的氣，而利用乳糖時不能產酸和氣。另外，菌株LKH可以在分別以葡萄糖、乳糖、魔芋精粉、纖維素、油酸、亞油酸、亞麻酸及花生油為唯一碳源的M9培養基上生長，但不能以正辛酸或正癸酸作為唯一碳源生長。菌株LKH可以在40 ℃生長，但不能在4 ℃生長，其最適生長溫度為28 ℃，最適生長pH值為7.0。

表1 菌株LKH的生理生化特征

注：+代表陽性結果；-代表陰性結果；N代表未知。

2.2.5 系統發育樹

對菌株LKH的16S rDNA的PCR擴增產物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4(a)所示，可見PCR擴增產物在1500 bp左右有清晰條帶。將PCR擴增產物切膠回收后，連接到pMD18-T質粒上，構建重組載體pMD-LKH，其PCR鑒定結果見圖4(b)。將重組載體送交測序，獲得一段長1449 bp的核苷酸序列，利用NCBI數據庫提供的BlastN功能進行核苷酸比對，結果顯示菌株LKH與類芽孢桿菌屬的依利諾斯類芽孢桿菌(Paenibacillusillinoisensis)的親緣關系最接近，其中與P.illinoisensisF24菌(登錄號JQ579623.1)、NBRC 15959(登錄號NR_113828.1)、JCM 9907(登錄號NR_040884.1)的序列一致性高達99%。根據16S rDNA序列的相似性，利用Clustal Omega和Mega 5.0軟件構建系統發育樹，如圖5所示，圖中括號內為基因序列的登錄號。由圖可見，菌株LKH與P.illinoisensis的進化關系最近。

(a)16S rDNA基因的PCR擴增產物 (b)質粒pMD-LKH的PCR鑒定產物

圖4PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.4ElectrophoretogramofPCRproducts

圖5 根據16S rDNA序列的同源性構建的系統發育樹

綜上所述，菌株LKH歸屬于依利諾斯類芽孢桿菌P.illinoisensis。P.illinoisensis是1997年由Shida等從Bacilluscirculans的第6組中抽出來歸到類芽孢桿菌屬[18]。P.illinoisensis的細胞是桿狀，大小為(0.5～0.8)μm×(3.0～5.0)μm，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，可運動，產橢圓形芽孢。從個體和菌落的形態及生理生化特征(見表1)上看，菌株LKH與依利諾斯類芽孢桿菌及M17菌都很接近，但是這3種菌株的某些生理生化特征存在著一定的差異，譬如：菌株LKH的最適生長溫度為28 ℃，V-P反應為陽性，能夠利用檸檬酸鹽，脲酶反應為陽性，吲哚反應和硝酸鹽還原試驗均為陰性，而菌株NRRL NRS-1356的最適生長溫度為37 ℃，V-P反應為陰性，不能利用檸檬酸鹽，菌株M17的脲酶反應和V-P反應為陰性，硝酸鹽還原試驗和吲哚反應均為陽性。生理生化特征的差異反映了這些菌株的生存環境和自身遺傳背景的不同。

目前發現的可以在胞內積累PHAs的微生物種類很多，主要有產堿桿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅螺菌屬(Rhodospiriclum)、甲基營養菌屬(Methylotrophs)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、固氮菌屬(Azotobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、極端嗜鹽桿菌(Haloferax)等[5,17,20-21]。類芽孢桿菌屬是一類廣泛存在于自然界的好氧/兼性厭氧、可產生芽孢的桿狀細菌，在生物醫藥、生物修復等領域都有重要的應用[22]。雖然迄今為止鮮有類芽孢桿菌屬胞內積累PHBs的報道，但是，考慮到多數類芽孢桿菌屬的菌種是從芽孢桿菌屬抽出重新分類的，相信今后有關類芽孢桿菌屬中提取出PHBs的報道會層出不窮。

2.3 菌株LKH的生長曲線

根據不同時間取樣的菌株LKH懸浮液的OD600繪制生長曲線，如圖6所示。菌株LKH在0～4 h內處于生長延滯期，生長較為緩慢；4～24 h之間菌體進入對數生長期；24 h后，菌株開始達到生長穩定期，此時生物量達到最大值；培養至96 h后，菌株開始進入衰亡期。由于PHB是微生物在非平衡的營養條件下進行胞內合成的，故定于第4天提取PHB。

圖6 菌株LKH的生長曲線

2.4 菌株LKH的PHB發酵條件優化

2.4.1 碳源種類對PHB合成的影響

不同碳源培養的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率如表2所示。從表2中可以看出，菌株LKH在以葡萄糖為唯一碳源的條件下提取獲得PHB的質量最多，含量(即純度)也最高(達到43.89%)；菌株LKH以油酸為唯一碳源生長時的PHB提取率最高(49.70%)；菌株LKH以魔芋精粉為唯一碳源合成PHB的質量可達0.52 g/L，含量達到40.62%，PHB提取率可以達到40.25%。

表2 不同碳源培養的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率

圖7 以魔芋精粉和葡萄糖為唯一碳源培養的菌株LKH中所提取PHB的紅外光譜

不同碳源培養的菌株LKH中提取出來的白色薄膜樣品經甲酯化后進行氣相色譜分析，其結果顯示均與PHB標準品一致。圖8為PHB標準品、分別以魔芋精粉和葡萄糖為唯一碳源培養的菌體中合成的白色薄膜樣品的氣相色譜。由圖可見，提取的樣品在1.49 min附近出現氯仿峰，在1.67min附近出現甲酯化的PHB單體組分峰，在5.42min附近出現內標物苯甲酸的峰，表明提取物中含有一定量的PHB。但是，氣相色譜圖中還有很多雜峰，表明提取的PHB純度不高，這與前面所測的PHB含量約為40%的結果符合。

(a)PHB標準品

(b)以魔芋精粉為碳源發酵提取的PHB

(c)以葡萄糖為碳源發酵提取的PHB

2.4.2 氮源濃度對PHB合成的影響

聚羥基烷酸酯是一類微生物在不平衡的生長條件下胞內合成的碳源和能源貯藏物，所謂不平衡生長條件為碳源相對過量，氮源等營養物質相對缺乏。因此，本試驗在固定碳源為魔芋精粉的基礎上，考察了不同氮源(NH4Cl)濃度對PHB合成的影響，結果如表3所示。從表3中可知，氮源濃度越低，即C/N比越大，PHB的提取率就越高；在氮源濃度為0.2 g/L時，PHB的質量達到最高(0.85 g/L)，含量高達69.55%，提取率達到93.29%。

表3 不同氮源濃度下培養的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率

3 結論

(1)從云南種植魔芋的土壤中分離得到了一株能以魔芋多糖為唯一碳源生長的菌株LKH，該菌能夠分泌β-甘露聚糖酶水解魔芋多糖生長，經蘇丹黑染色鑒定，菌株可以在胞內積累PHB。

(2)經形態學、生理生化鑒定和16s rDNA序列同源性分析，菌株LKH歸屬為依利諾斯類芽孢桿菌Paenibacillusillinoisensis。

(4)在氮源濃度為0.2 g/L的條件下，菌體LKH以魔芋多糖為唯一碳源合成的PHB質量高達0.85 g/L，含量高達69.55%，PHB提取率為93.29%。P.illinoisensisLKH在發酵魔芋多糖生產魔芋低聚糖的同時可胞內合成PHB，實現了菌體廢棄物的二次開發利用，有望降低微生物發酵生產PHB的成本。

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