免標記自增強電化學發光免疫傳感器超靈敏檢測河豚毒素

劉 媛，王 邃

(寧波大學 材料科學與化學工程學院，寧波市新型功能材料及其制備科學國家重點實驗室培育基地，浙江 寧波 315211)

圖1 河豚毒素的結構Fig.1 Structure of tetrodotoxin

河豚毒素(TTX)是一種毒性很強的小分子海洋神經毒素(結構如圖1)，其分子量為319 Da，廣泛分布于各種海洋生物體內[1-3]。河豚魚組織中的河豚毒素含量高于1 000 MU·g-1時，可通過食物鏈在人體內積累，有效阻斷神經興奮性膜鈉通道并阻礙神經傳導，可導致人神經麻痹和死亡[4]。目前，河豚毒素的檢測已有很多文獻報道，但生物法測定比較耗時且昂貴；色譜和色譜-質譜聯用法雖是國家標準方法，但對儀器和實驗室的要求較高[5-6]；表面等離子體共振(SPR)技術目前尚處于研究的初期階段，由于技術成熟度和儀器普及度等因素還難以實用化[7]；ELISA 的復雜操作和高成本也使之應用受限[8]。因此，有必要建立一種簡單有效的方法檢測TTX。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗室自組裝ECL檢測系統由BPCL超微弱發光分析儀(中國科學院生物物理研究所)和CHI1110B電化學分析儀(上海辰華儀器有限公司)構成。三電極體系：裸電極或修飾的玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)作為工作電極，鉑絲電極作為對電極,Ag/AgCl(3 mol·L-1KCl)電極作為參比電極。使用CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)進行電化學阻抗譜(EIS)分析。使用Hitachi SU-70掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi，Tokyo，Japan)對納米材料的形貌進行表征。

1.2 AuNPs的制備

參照文獻[18-19]，將50 mL 0.01% 的HAuCl4溶液攪拌加熱至沸騰后迅速加入2 mL 1%檸檬酸鈉，溶液煮沸約10 min，當顏色由黃色變成黑色再變成酒紅色即得到AuNPs溶膠，冷卻至室溫并于4 ℃保存備用。

1.4 電化學發光免疫傳感器的制備

玻碳電極預處理：依次用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉末將電極拋光至鏡面，分別置于水、乙醇、水中超聲各1 min，用氮氣將電極表面吹干備用。

圖2 電化學免疫傳感器的制備流程和檢測機制Fig.2 Fabrication process and detection mechanism of the ECL immunosensor

1.5 TTX的測定

TTX標準樣品溶液的配制：稱取5 mg 的TTX樣品，溶于10 mL 醋酸(5%，質量分數),得到質量濃度為500 mg·L-1的TTX 儲備液,用水稀釋得到其他質量濃度的TTX標準樣品溶液。

將制得的ECL免疫傳感器置于100 μL 不同質量濃度的TTX 標準樣品溶液中，37 ℃下孵育1 h后，用水沖洗，置于0.1 mol·L-1的PBS(pH 7.4)測試液中進行ECL測定，并記錄數據。掃描電壓范圍為0～1.2 V，掃速為100 mV·s-1。

2 結果與討論

2.1 材料表征

2.2 電化學發光免疫傳感器的電化學行為

2.2.2電化學阻抗譜電化學阻抗也可以有效表征傳感器表面的電子傳遞速率變化。在含有5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-和 0.1 mol·L-1KCl 的PBS(0.1 mol·L-1，pH 7.4)溶液中對不同修飾電極的阻抗值進行測定。阻抗圖中曲線的半圓直徑越大，表明電極表面阻礙[Fe(CN)6]3-/4-電子傳遞的能力越大。如圖4B所示,隨著材料的逐級修飾，不同修飾電極(曲線a～e)的阻抗值逐漸變大，這與循環伏安的測定結果相一致，表明該生物傳感器構建成功。

2.3 實驗條件的優化

為獲得最佳的測試條件，提高TTX的檢測靈敏度，分別對緩沖溶液的pH值和目標物的孵育時間進行優化。考察了緩沖溶液pH值在6.0～8.5范圍內對ECL強度的影響。結果表明，pH值在6.0～7.5范圍內，ECL強度隨著pH值的增加而增加，而在pH 7.5～8.5范圍內，ECL強度隨著pH值的增加而減小，在pH 7.5時，ECL強度達到最大。這可能是由于測試液的pH值影響蛋白質分子的活性，在強酸強堿條件下，導致蛋白質分子失活。因此，本實驗選擇PBS的最佳pH值為7.5。

電化學免疫傳感器對抗原的孵育時間也是影響ECL強度的重要因素。本實驗考察了孵育時間(15～90 min)對ECL強度的影響。結果顯示，孵育時間在15～60 min范圍內，ECL強度隨著時間的延長而增大，在60～90 min范圍內，ECL強度無明顯變化。這可能是由于電極表面抗體的數量有限，孵育60 min時目標物結合已達到飽和狀態。因此，選擇最佳孵育時間為60 min。

圖5 ECL信號隨TTX濃度變化的響應圖Fig.5 ECL intensities of the immunosensor after fabricating with different concentrations of TTX in 0.1 mol·L-1 PBS(pH 7.4)insert:calibration curves for TTX determination;concentration of TTX(a-h):0.01,0.1,1,5,10,50,100,1 000 μg· L-1

2.4 TTX的檢測

用0.1 mol·L-1pH 7.4的PBS 配制不同濃度的TTX標準溶液，孵育完成后，置于測試底液中，考察了ECL信號響應隨濃度的變化情況。如圖5所示,在0.01～1 000 μg·L-1質量濃度范圍內，ECL信號響應值(y)隨TTX質量濃度(C)的增加而增強，其線性回歸校準曲線如圖5插圖所示，擬合方程為y=2 528.98+653.71 lgCTTX(μg·L-1)，相關系數為0.996。TTX的檢出限(S/N=3)為0.01 μg·L-1。與其他檢測TTX的方法相比(見表1)，該免疫傳感器具有線性范圍寬和檢出限低的優點。

2.5 穩定性

ECL信號的穩定是傳感器用于檢測的基本條件。將修飾好的電極置于100 μL 1 000 μg·L-1TTX標準溶液中孵育60 min后進行穩定性測試，考察了電壓在0.2～1.2 V范圍內連續循環掃描10圈的ECL信號變化情況。結果表明達到一定的掃描時間后，ECL信號趨于穩定，相對標準偏差(RSD)為2.1%，表明該免疫傳感器具有很好的穩定性，適用于TTX的檢測。

表1 TTX檢測方法的比較Table 1 Comparison of the main methods reported for the determination of TTX

2.6 選擇性與重現性

為考察該免疫傳感器的選擇性，在相同實驗條件下，分別對100 μL濃度為10 mmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2、ZnCl2、葡萄糖、尿酸、抗壞血酸、膽紅素、溶菌酶溶液孵育過的傳感器的ECL信號強度進行檢測，發現其ECL信號強度與空白溶液孵育后的結果幾乎相同。用河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育過的ECL信號值約為其5倍；用包含所有上述物質的混合溶液(濃度與上述相同)進行測試，其結果與河豚毒素(1 mmol·L-1)孵育后的ECL信號強度近乎相同。實驗結果表明，該免疫傳感器對TTX具有良好的選擇性。

將制備好的ECL免疫傳感器置于4 ℃密閉保存，每2 d 于相同條件下進行ECL測量，20 d后的ECL值為初始值的97.8%，說明該修飾電極可以保持抗體的活性和數量。另選取不同批次的修飾電極對10 μg·L-1TTX進行檢測，其結果的RSD為6.3%，表明該免疫傳感器具有很好的重現性。

2.7 樣品加標回收率的測定

實際樣品溶液根據文獻制得[13]。通過標準加入法，取50 μL未測得TTX的樣品溶液，向其中加入50 μL不同濃度的TTX標準溶液，進行回收率測定。每份樣品做3次平行實驗，結果如表2所示，其回收率為98.0%～104.0%，RSD為3.5%～8.2%，表明該免疫傳感器具有較好的實用價值。

表2 實際樣品中TTX的檢測結果(n=3)Table 2 Detection results of TTX in real samples(n=3)

3 結 論

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