基于金納米簇檢測碘單質的熒光分析方法研究

曹雪玲，張東杰，李 鑫,任重遠，連麗麗

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院,吉林 吉林 132002；2.中國石油吉林石化公司，吉林 吉林 132000)

碘可以直接或間接參與生命活動，對人體的新陳代謝和成長起著重要作用[1]。任何必需的元素，過量或不足均將對人體產(chǎn)生影響，特別是微量元素對生命活動的影響更為顯著。人們主要從飲水、糧食、蔬菜和環(huán)境(如海水、人工降雨等)中獲取碘，而飲用水中的碘含量反映了一個地區(qū)碘營養(yǎng)的基本指標。若碘的攝入量不足會導致碘缺乏病，引起智力發(fā)育不良，并導致潛在的地方性甲狀腺腫或地方性克汀病等疾病[2-3]，但若碘攝入量超過生理需求，也會影響人體健康。

目前，檢測碘含量的方法包括比色法[4]、電泳法[6]、電化學法[5]、離子色譜法[7]、色譜法[8]等。然而這些方法在檢測過程中存在檢測范圍窄、檢出限高、操作條件苛刻或檢測成本過高等缺點。為克服上述不足，許多熒光探針被用于碘的檢測[9-10]，其中蛋白質保護的金納米簇具有生物兼容性、水溶性及光學性能優(yōu)異等特點，作為熒光探針得到了廣泛應用[11-13]。例如：基于碘可以誘導金納米簇的熒光增強，谷胱甘肽保護的金納米簇被用作熒光探針檢測碘[14]，檢出限為400 nmol/L。文獻[15]利用組氨酸保護金納米簇檢測碘，方法的檢測范圍寬，靈敏度良好。本課題組利用蛋白質保護的金納米簇作為熒光探針建立了碘單質的檢測方法，但未對金納米簇與碘的作用機理做明確解釋[16]。

本文利用牛血清白蛋白保護的金納米簇(AuNCs@BSA)為熒光探針，高靈敏地檢測了碘單質，并利用Stern-Volmer方程進行了熱力學計算，對碘與金納米簇的作用機理進行了詳細研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀RF-5301pc型(日本島津公司)；FLS980穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司)；Bruker Vertex 80 V傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR,布魯克公司)；62A DS圓二色譜儀(美國Aviv公司)；UV-3100光譜儀(日本Shimadzu公司)。

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)購于Sigma-Aldrich公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)購于北京化學試劑公司。G-75凝膠購于 Sigma-Aldrich 公司，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

熒光發(fā)射光譜：氙燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長為350 nm，掃描范圍為550～750 nm，狹縫為5 nm×5 nm。圓二色譜采用0.1 cm光程的石英池，掃描波長為190～260 nm，所有數(shù)據(jù)掃描3次。傅立葉變換紅外光譜儀：配MCT-B 液氮冷卻檢測器。溴化鉀壓片,光譜采集范圍:400～4 000 cm-1。

1.3 金納米簇制備

基于文獻方法制備金納米簇[17-18]：在37 ℃下，取5 mL 50 mg/mL的 BSA恒溫10 min，加入5 mL 10 mmol/L HAuCl4,磁力攪拌2 min后，再加入0.5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，然后將此反應液在微波反應器中于37 ℃下反應12 h。制備的金納米簇粗產(chǎn)品用分子量為 8 000～14 000 Da的透析袋透析24 h；未反應的BSA用 G-75凝膠分子篩柱去除；將金納米簇冷凍干燥為粉末，備用。

圖1 金納米簇的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectra of the prepared AuNCs@BSAinsert：the lifetime of the prepared AuNCs@BSA

圖2 金納米簇中加入不同濃度碘的熒光猝滅圖Fig.2 Emission spectra of AuNCs@BSA(0.5 g·L-1) in the presence of different concentrations of iodineinsert:relationship between ΔIF and concentration of iodine；concentration(a-g):0,0.5,1,5,15,25,35 μmol/L

2 結果與討論

2.1 金納米簇檢測碘單質的方法建立

2.1.1金納米簇的表征在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長610 nm下，AuNCs@BSA的熒光光譜圖見圖1，與文獻制備的含有16個金的AuNCs@BSA基本一致。圖1插圖為AuNCs@BSA的熒光壽命圖，擬合計算得到其熒光壽命約為11 μs，與Hu等[19]制備的AuNCs@BSA的熒光壽命(11 μs)一致。綜上所述，本文制備的產(chǎn)物為金納米簇。

2.1.2分析方法的建立由碘單質對金納米簇的熒光猝滅圖(圖2)可知，AuNCs@BSA在610 nm有較強的熒光發(fā)射峰，因碘單質可在較寬的pH值范圍內引起金納米簇的熒光發(fā)射峰猝滅。本實驗選擇在pH 8.3(制備金納米簇后的pH值)條件下加入碘溶液。實驗結果顯示，AuNCs@BSA的熒光猝滅現(xiàn)象隨著碘溶液加入量的增加而增強，當?shù)饧尤肓窟_到35 μmol/L時，AuNCs@BSA的熒光基本完全猝滅，且最大發(fā)射峰的峰位藍移至590 nm，此時AuNCs@BSA的熒光峰位置及強度均發(fā)生很大改變，推測AuNCs@BSA內金核的微環(huán)境發(fā)生了較大變化，碘與AuNCs@BSA之間存在強的相互作用[20]。

以AuNCs@BSA加入碘前后的熒光強度(ΔIF=IF0-IF)與碘濃度進行線性回歸，結果表明ΔIF與碘濃度(c)在2.0 nmol/L～35 μmol/L范圍內線性關系良好，線性方程為ΔIF=7.840c+10.937，相關系數(shù)r=0.997 7(見圖2插圖)。逐級稀釋AuNCs@BSA使其信噪比為3，加入不同濃度的碘，繪制熒光強度與濃度之間的關系曲線，計算得到檢出限為1.8 nmol/L。

表1 實際樣品中碘含量的測定結果Table 1 Determined results of iodine in real samples

2.2 實際樣品中碘含量的測定

我國規(guī)定居民飲用水中碘含量應在10 μg/L，若飲用水中的碘含量小于5 μg/L，則會出現(xiàn)地方性甲狀腺腫病，而含量超過150 μg/L時也會威脅人體健康[21]。實驗選擇飲用水為實際樣品，水樣經(jīng)濃縮處理后，采用升華的方法使碘離子轉化為碘單質，進行檢測。分別利用此方法和ICP-MS[21]檢測了樣品中的總碘含量，結果見表1。由表1可見，利用本方法檢測的碘含量與ICP-MS檢測結果差別不大，說明本方法可應用于實際樣品的檢測。

圖3 干擾離子對金納米簇的干擾試驗Fig.3 Influence of the fluorescence emission intensity with different interference ions in AuNCs@BSA

2.3 干擾試驗

2.4 作用機理研究

2.4.1熱力學參數(shù)計算熒光猝滅是熒光物質與溶劑或溶質分子之間發(fā)生熒光強度降低的過程，實質是發(fā)光過程相互競爭從而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程。熒光猝滅作用可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光劑的激發(fā)態(tài)能量轉移或電荷轉移而導致；而靜態(tài)猝滅則是猝滅劑與熒光劑基態(tài)之間相互作用所致[22]。為闡明碘單質與AuNCs@BSA的熒光猝滅機理,用Stern-Volmer方程對碘單質與AuNCs@BSA濃度依賴的變溫數(shù)據(jù)進行分析：

IF0/IF=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

圖4 金納米簇與碘的Stern-Volmer曲線Fig.4 Stern-Volmer curves under different temperatures of AuNCs@BSA with I2

式(1)中IF0和IF分別為加入猝滅劑前后AuNCs@BSA的熒光強度，KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為猝滅過程速率常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度，τ0為熒光劑分子平均壽命，由圖1B可知AuNCs@BSA熒光壽命約為11 μs。以IF0/IF對[Q]作圖，并計算出不同溫度下的Kq和KSV。由圖4可知，在298、308、318 K的溫度下IF0/IF與[Q]呈良好的線性關系。表2結果表明，KSV隨溫度的升高而減小,KSV均小于2.0×1010L/mol·s。由于2.0×1010L/mol·s為生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)，大于此值定義為靜態(tài)猝滅，而小于此值定義為動態(tài)猝滅[22]，因此，可確定本文碘單質誘導AuNCs@BSA熒光猝滅為動態(tài)猝滅過程。

基于修正的Stern-Volmer方程(2)，利用IF0/(IF0-IF)與[Q]作圖，其中Ka為有效猝滅常數(shù)，fa為接近猝滅體的分數(shù)。實驗結果表明，IF0/(IF0-IF)與[Q]呈良好的線性關系，且Ka值隨著溫度升高而逐漸減小，這與KSV的變化趨勢一致,進一步證明碘單質引起的AuNCs@BSA熒光猝滅是動態(tài)猝滅過程。由式(2)計算出不同溫度下的有效猝滅常數(shù)Ka，帶入式(3)和(4)，R為氣體常數(shù)，分別計算熱力學參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG(表3)，發(fā)現(xiàn)ΔH>0且ΔS>0，表明碘與AuNCs@BSA之間的相互作用屬于疏水作用[23-24]。

表2 不同溫度下金納米簇與碘的KSV和KqTable 2 Stern-Volmer quenching constants(KSV )and the quenching rate constants(Kq )of I2 binding to AuNCs@BSA at various temperatures

表3 金納米簇與碘在不同溫度下的熱力參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for I2 binding to AuNCs@BSA at different temperatures

IF0/(IF0-IF)=1/(fa·Ka·[Q])+1/fa

(2)

lgKa=-ΔH/(2.303RT)+ΔS/(2.303R)

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

2.4.2熒光響應機理研究據(jù)文獻[25]報道，AuNCs@BSA中的金核與BSA通過Au—S相結合，金納米簇中的配體蛋白質結構對AuNCs@BSA熒光變化起到關鍵作用，如果配體蛋白質的二級結構發(fā)生變化，會導致AuNCs@BSA的熒光光譜變化。所以本文推測碘單質引起AuNCs@BSA熒光發(fā)射峰的猝滅，主要原因在于碘的加入使配位的BSA構象發(fā)生變化，測定了BSA及加入碘前后AuNCs@BSA的紅外光譜圖,發(fā)現(xiàn)合成的AuNCs@BSA及加入碘的紅外光譜中只有微小的變化(圖5A)，不利于分析蛋白質二級結構的變化。圖5B分別為配體BSA、AuNCs@BSA及加入碘后的AuNCs@BSA的圓二色譜圖，由圖可知配體BSA的圓二色譜圖中有 222、210 nm兩個負峰，兩峰均為α-螺旋結構的特征峰。BSA與金核通過Au—S結合后，其在222 nm處的峰強度較BSA的峰強度弱，使得210 nm處的峰移至208 nm，表明α-螺旋的含量減少，而無規(guī)卷曲的結構增多，說明已形成金納米簇，這與之前的報道相符[26]。而碘加入到AuNCs@BSA中后，222 nm的峰強度較AuNCs@BSA進一步變弱，說明α-螺旋的結構繼續(xù)減少，而無規(guī)卷曲的含量增多。綜上所述，碘的加入影響了配體BSA的蛋白質二級結構，這可能是引起AuNCs@BSA熒光猝滅的重要原因，詳細的機理有待于繼續(xù)研究。

3 結 論

本文以AuNCs@BSA為熒光探針，建立了碘單質的檢測方法，并應用于實際樣品中碘單質的檢測。詳細探討了其熒光猝滅機制，并利用Stern-Volmer方程計算和分析熒光數(shù)據(jù)。熒光猝滅速率常數(shù)值說明碘單質引起AuNCs@BSA的熒光發(fā)射峰猝滅屬于動態(tài)猝滅過程，熱力學參數(shù)計算結果表明碘與AuNCs@BSA之間主要是疏水作用。結合圓二色譜及紅外光譜圖的結果，認為碘與配體BSA產(chǎn)生相互作用，引起了BSA的二級結構變化，從而誘導AuNCs@BSA的熒光光譜猝滅。

參考文獻：

[1] Pan Y,Zhang X G,Li Y.WaterRes.,2016,88(1):60-68.

[2] Hye J K,Na K K,Hyeong K P.Eur.J.Nutr.,2017,56(3):965-971.

[3] Huang H,Zhu J.Biosens.Bioelectron.,2009,25(4):927-930.

[4] Jung E,Kim S,Kim Y,Seo S H,Lee S S,Han M S,Lee S.Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50(19):4486-4487.

[5] Ito K,Ichihara T,Zhuo H,Kumamoto K,Timerbaev A R,Hirokawa T.Anal.Chim.Acta,2003,497(1/2):67-74.

[6] Fujiwara T,Mohammadzai H,Inoue H,Kumamaru T.Analyst,2000,125:759-763.

[7] Bichsel Y,Von Gumten U.Anal.Chem.,1999,71(1):34-38.

[8] Hu W,Yang P J,Hasebe K,Haddad P R,Tanaka K.J.Chromatogr.A,2002,956(1/2):103-107.

[9] Chen Y M,Cheng T L,Tseng W L.Analyst,2009,134(10):2106-2112.

[10] Wei S C,Hsu P H,Lee Y F,Lin Y W,Huang C C.ACSAppl.Mater.Int.,2012,4(5):2652-2658.

[11] Yan X,Li H,Hu T,Su X.Biosens.Bioelectron.,2017,91(15):232-237.

[12] Wang L L,Qiao J,Qi L,Xu X,Li D.Sci.Chin.Chem.,2015,58(9):1508-1514.

[13] Liu J M,Chen J T,Yan X P.Anal.Chem.,2013,85(6):3238-3245.

[14] Wang M,Wu Z K,Yang J,Wang G Z,Wang H Z,Cai W P.Nanoscale,2012,4(14):4087-4090.

[15] Wang Y F,Zhu H Y,Yang X M,Dou Y,Liu Z D.Analyst,2013,138(7):2085-2089.

[16] Cao X L,Luo Y N,Lian L L,Wu Y Q,Lou D W.Chem.Lett.,2015,44:1392-1394.

[17] Xie J P,Zheng Y G,Ying J Y.J.Am.Chem.Soc.,2009,131(3):888-889.

[18] Yue Y,Liu T Y,Li H W,Liu Z Y,Wu Y Q.Nanoscale,2012,4(7):2251-2254.

[19] Hu D H,Sheng Z H,Gong P,Zhang P F,Cai L T.Analyst,2010,135(6):1411-1416.

[20] Lee K Y,Kim D W,Heo J,Kim J S,Yang J K,Cheong G W,Han S W.Bull.KoreanChem.Soc.,2006,27(12):2081-2083.

[21] Mo X M,Liang X X,Chen Y M,Peng Z Y,Du E Q.Chin.J.HealthLab.Technol.(莫曦明，梁旭霞，陳硯朦，彭寨玉，杜二青.中國衛(wèi)生檢驗雜志),2006,16(10):1179-1180.

[22] Lakowicz J R.PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy.2nd.New York：Plenum Press,1999：237.

[23] Jiang C Q,Gao M X,Meng X Z.Spectrochim.ActaA,2003,59(7):1605-1610.

[24] Ross D P,Subramanian S.Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.

[25] Zhang M,Dang Y Q,Li H W,Wu Y Q,Li Q,Wang K,Zou B.J.Phys.Chem.C,2013,117(1)：639-647.

[26] Estey T,Kang J C,Schwendeman S P,Carpenter J F.J.Pharm.Sci.,2006,95(7):1626-1639.