基于表面增強拉曼光譜的冠心病前瞻性診斷方法研究

楊薈楠，趙 暢，李 蓉，沈成興，蔡小舒*，駱城芳

(1.上海理工大學能源與動力工程學院， 上海200093； 2.上海市動力工程多相流動與傳熱重點實驗室， 上海 200093；3. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院， 上海 200093)

0 引言

近些年來，隨著人民飲食習慣與生活方式的改變、人口老齡化等原因，冠心病的發病率逐漸上升，死亡率居高不下。2014年，中國農村冠心病的死亡率為143.72/10萬，城市冠心病的死亡率為136.21/10萬[1]。目前臨床上用于診斷冠心病的常見方法為冠狀動脈造影技術，冠狀動脈造影技術雖然被稱為診斷冠心病的 “金標準”，但是價格昂貴而且是有創的檢測方法，所以利用心電圖對冠心病進行診斷的方法也逐漸發展起來。心電圖診斷雖然操作簡單方便、價格低廉，但誤診與漏診的情況卻時有發生，因此無法作為一種可靠的冠心病臨床診斷方法。因此，發展一種無創的、靈敏度高、可靠性強的冠心病早期快速檢測方法具有非常重要的意義。

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)已經廣泛應用于生命科學領域，對極低濃度的生物分子進行檢測[2-4]。例如，Alula等基于SERS光譜技術，通過光催化作用后的磁性物質修飾銀納米顆粒，檢測到尿液中濃度極低的肌酸酐[5]。Ma等基于SERS光譜技術，利用磁性物質誘導納米顆粒聚沉，檢測到細菌中濃度極低的脫氧核糖核酸[6]。

血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，pDGF-BB)通過多種機制參與動脈粥樣硬化發生發展過程，與冠心病的關系較為密切[7]。目前針對pDGF-BB的研究，較多的是基于酶聯免疫吸附法對血液中的pDGF-BB進行檢測。例如，曾宇然等通過酶聯免疫吸附法對血漿中pDGF-BB濃度進行檢測，發現pDGF-BB對頸動脈粥樣硬化的發生發展過程具有重要的作用[8]。本課題組在前期研究中，首先通過自行搭建的785 nm拉曼光譜測試平臺對不同的極低濃度的pDGF-BB水溶液SERS光譜進行檢測分析，發現拉曼頻移為1 509 cm-1的拉曼特征峰歸屬于pDGF-BB水溶液[9]。

本文基于SERS光譜技術60例冠心病患者，其中包括20例行皮冠狀動脈介入治療術(percutaneous coronary intervention，pCI)病人與40例未行pCI病人以及18例健康人的尿液樣本進行檢測， 結合pDGF-BB拉曼頻移為1 509 cm-1的特征峰進行分析，并與醫院提供的冠狀動脈造影技術臨床資料對比，發現兩種方法在判斷心血管堵塞程度是否達到70%以上吻合度較高，表明該方法有望對冠心病疑似病例進行早期診斷，為患者是否需要進行pCI提供重要依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器與光譜預處理

實驗中使用自行搭建的785 nm拉曼光譜測試平臺，如圖1所示，中心波長為785 nm的激光穿過帶通濾波片(OD6，Edmund)聚焦在比色皿上，透鏡組90°接收的拉曼散射光通過光譜儀(iHR320)，由CCD探測器(Horiba-Syncerity)將光信號轉變為電信號，傳輸到計算機中[10]。光譜采集選擇1 200 grooves/mm的光柵，積分時間10 s，積分次數4次，采集后首先選擇1 200-1 600 cm-1范圍內的光譜[11]，采用4個相鄰像素點的2次savitzky-golay平滑[12]濾除噪聲干擾，同時采用4階多項式擬合進行基線校正，從而有效的克服了人工干預和單次擬合造成的光譜畸變[13]。每個樣本采集5次，取其平均譜線作為后續分析使用。

1.2 實驗樣本的準備

實驗中所用的尿液樣本分別采集于60例冠心病患者，其中包括20例行pCI病人，平均年齡為64±15歲；40例未行pCI的病人，平均年齡為61±16歲；18例健康人，平均年齡為52±12歲。所有的健康人與冠心病患者的尿液樣本均由上海交通大學醫學院附屬新華醫院提供，為行pCI術前尿液樣本，采集后保存在4 ℃的恒溫箱中保存一到兩個小時。此外，所有的受試者均簽署知情同意書，對本課題組的實驗研究表示理解與支持。實驗中，大多數的尿液樣本均無沉淀產生，然而對于某些已產生沉淀的尿液樣本，常常對其進行離心處理，取其上清液用于實驗研究。

圖1 785納米拉曼光譜測試平臺Fig.1 The schematic diagram of 785 nm Raman spectrometer

2 實驗結果與討論

2.1 冠心病患者與健康人的尿液樣本SERS光譜圖

0.5 mL的冠心病患者以及健康人的尿液樣本上清液分別與1 mL的銀納米膠體溶液(粒徑分布為40-60 nm)均勻混合，置于比色皿中，檢測SERS光譜，實驗結果如圖2所示。其中譜線(A)為冠心病患者中一例代表性的行pCI病人的尿液樣本SERS光譜，譜線(B)為健康人尿液樣本SERS光譜。通過對比兩條譜線，可以發現冠心病患者(行pCI病人)尿液樣本SERS光譜中可以檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰，而在健康人尿液樣本中則檢測不到。在前期研究中通過檢測不同極低濃度pDGF-BB水溶液的SERS光譜，可以在濃度低至0.01 ppmol/L的pDGF-BB水溶液中檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰[9]。這就說明了冠心病行pCI患者尿液樣本中pDGF-BB的濃度相對較高；而健康人尿液樣本中的pDGF-BB的濃度低于0.01 ppmol/L或幾乎為零。

2.2 60例冠心病患者尿液樣本與18例健康人尿液樣本SERS平均光譜圖

在實驗中通過785 nm拉曼光譜測試平臺對20例行pCI病人的尿液樣本、40例未行pCI病人的尿液樣本與18例健康人尿液樣本進行檢測，取尿液樣本0.5 mL，加入銀納米膠體溶液1 mL，采集SERS光譜。

圖2 冠心病(行pCI)患者(譜線A)與健康人(譜線B)尿液樣本SERS光譜圖Fig.2 The SERS spectra of urine samples from the patient with CHD (with pCI) (Spectrum A) and the healthy human (Spectrum B)

圖3 行pCI病人尿液平均SERS光譜圖(A)、未行pCI病人尿液平均SERS光譜圖(B)與健康人尿液平均SERS光譜圖(C)Fig.3 The average SERS spectra of the urine samples from the patients with pCI (Spectrum A); the patients without pCI (Spectrum B) and the healthy human (Spectrum C)

得到20例行pCI病人尿液樣本、40例未行pCI病人尿液樣本與18例健康人尿液平均SERS光譜如圖3所示：三條尿液平均SERS光譜在結構上很相似，1 245 cm-1、1 268 cm-1、1 281 cm-1、1 320 cm-1、1 390 cm-1、1 464 cm-1、1 568 cm-1的拉曼特征峰在三條平均SERS光譜中均可檢測。這些特征峰對應于尿液中有機物的不同共價鍵或者官能團的振動模式，例如1 245 cm-1歸屬于酰胺Ⅲ帶無規則卷曲；1 320 cm-1歸屬于C-H鍵扭轉振動[14]；1 460 cm-1歸屬于類脂特征峰，為膜蛋白與膜脂?；鵆H2，CH3的彎曲振動[15]。在三類尿液平均SERS光譜中，可以發現20例行pCI病人的尿液樣本平均SERS光譜中可以檢測到拉曼頻移約為1 509 cm-1(1 510 cm-1)的特征峰而在40例未行pCI病人尿液樣本平均SERS光譜與18例健康人尿液樣本平均SERS光譜中檢測不到，拉曼峰的略微偏移可能是由于激光器波長的略微偏移所致。這也進一步揭示了pDGF-BB在三類尿液樣本中的濃度不同，在行pCI病人尿液中，pDGF-BB的濃度相對較高，在未行pCI病人尿液與健康人尿液中則濃度極低。

2.3 SERS光譜與冠狀動脈造影技術對比

結合1 509 cm-1歸屬于pDGF-BB的特征峰，將60例冠心病患者的尿液樣本SERS光譜與冠狀動脈造影技術臨床資料進行對比，結果如表1所示。其中冠狀動脈造影技術檢測的心血管包括左主干(left main coronary artery，LM)，左前降支(left anterior descending branch，LAD)，左回旋支(left circumflex artery，LCX)和右冠狀動脈(right coronary artery，RCA)，其中(+)表示行pCI，(-)表示未行pCI。

表1 20例行pCI病人尿液樣本SERS光譜中1 509 cm-1特征峰的檢測結果與臨床資料對比

Tab.1 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of 20 patients with pCI

編號1509cm?1+/?LAD%LCX%LM%RCA%總和%1√+9585?602402√+4060?901903√+50100?502005×+4095?902257√+509050902808√+4090405022011√+???959512√+6090?5020014√+100??9519519√+?90?8017020√+???999930√+?90??9031√+?90?6015032×+3070??10034√+70???7040√+909030?21042√+?80?5013043×+90??6015046√+?85?8016547√+50??90140

通過分析20例行pCI病人的尿液SERS光譜發現，85%的行pCI病人的尿液樣本中均可檢測到1 509 cm-1的特征峰；而且行pCI病人的心血管堵塞程度非常嚴重，均存在有一單支心血管堵塞程度不小于70%。例如，20號、30號、31號病人的冠狀動脈造影圖如圖3所示，20號病人RCA堵塞程度為99%，如圖3(a)所示；30號病人LCX堵塞程度為90%，如圖3(b)所示；31號病人LCX堵塞程度為90%，如圖3(c)所示。這也就進一步表明了，當病人的單支心血管堵塞程度不小于70%，其尿液SERS光譜中可以檢測到1 509 cm-1的拉曼特征峰，5號、32號以及43號病人除外，這可能是因為在檢測過程中這些病人尿液樣本中的pDGF-BB已完全變性。通過分析40例未行pCI病人的尿液SERS光譜發現，87.5%的尿液樣本中均檢測不到1 509 cm-1的特征峰；而且未行pCI病人的心血管堵塞程度輕，單支心血管的堵塞程度均小于70%，6號病人RCA未見明顯堵塞，如圖3(d)所示。綜上所述，以上兩類病人所占總病人的比例為86.7%。

圖4 (a)20號病人RCA動脈造影圖像；(b)30號病人LCX動脈造影圖像；(c)31號病人LCX動脈造影圖像；(d)6號病人RCA動脈造影圖像Fig.4 (a) The image of coronary angiography of RCA from patient No.20; (b) The image of coronary angiography of LCX from patient No.30; (c) The image of coronary angiography of LCX from patient No.31; (d) The image of coronary angiography of RCA from patient No.6

值得注意的是，在40例未行pCI病人尿液的SERS光譜中，有幾例樣本可以檢測到1 509 cm-1的特征峰，如表2與表3所示。

表2 未行pCI病人尿液SERS光譜中1 509 cm-1特征峰檢測結果與臨床資料對比(1)

Tab.2 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of patients without pCI (part I)

編號27361509cm?1√√(+)/(-)??LAD%?30LCX%3040LM%??RCA%50?總和%8070

從表2中可以看出，27號病人與36號病人的單支心血管的堵塞程度均小于70%，但LAD/LCA/LM/RAC的堵塞程度總和卻不小于70%。這也就說明了，當病人各支心血管堵塞程度總和不小于70%時，同樣可以在其尿液樣本SERS光譜中檢測到1 509 cm-1特征峰，這部分病人所占所有未行pCI病人的比例為5%。

表3 未行pCI病人尿液SERS光譜中1 509 cm-1特征峰檢測結果與臨床資料對比(2)

Tab.3 The appearance of 1 509 cm-1measured by SERS and clinical data of patients without pCI (part II)

編號4150511509cm?1√√√(+)/(-)???LAD%603030LCX%???LM%???RCA%???總和%603030

從表3中可以看出，41號、50號、51號病人的單支心血管堵塞程度小于70%，而各支心血管的堵塞程度總和也小于70%，而在這些病人的尿液樣本SERS光譜中卻可以檢測的1 509 cm-1的特征峰。結合醫院提供的病人腦部CT與頸動脈彩超等臨床資料，發現這類病人存在著不同程度的腦梗塞與頸動脈血管的堵塞情況，從而造成體內pDGF-BB濃度的上升，這類病人占所有未行pCI病人的比例為7.5%。

3 結論

基于SERS光譜對20例行pCI病人尿液樣本、40例未行pCI病人尿液樣本以及18例健康人尿液樣本進行檢測，并結合拉曼頻移為1 509 cm-1歸屬于pDGF-BB的拉曼特征峰對尿液SERS光譜進行分析，結果發現行pCI病人的尿液樣本中可檢測到1 509 cm-1的特征峰；健康人與大多數未行pCI病人的尿液樣本中則檢測不到1 509 cm-1的特征峰。同時結合醫院提供的冠狀動脈造影技術臨床資料，發現這種檢測方法與判斷心血管堵塞程度是否大于70%的吻合度較好，通過判別1 509 cm-1的拉曼特征峰對冠心病疑似病例單支血管堵塞程度是否大于70%的診斷靈敏度與特異性分別為85%；87.5%，所以該方法有望發展成為判斷冠心病患者是否需要行pCI的重要依據，為冠心病疑似病例的早期診斷提供非常有價值的信息。

[1] 隋輝, 陳偉偉, 王文. 《中國心血管報告2015》要點解讀[J]. 中國心血管雜志, 2016, 21(4):259-261.

SUI Hui, CHEN Weiwei, WANG Wen. Interpretation of reporter on cardiovascular disease in China (2015)[J]. Chin J Cardiovasc Med, 2016, 21(4):259-261.

[2] LIN J Q, CHEN R, FENG S Y,etal. A novel blood plasma analysis technique combining membrane electrophoresis with silver nanoparticle-based SERS spectroscopy for potential application in noninvasive cancer detection[J]. Nanomedicine:Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2011, 7(5):655-663.

[3] 周明輝, 廖春艷, 任兆玉, 等. 表面增強拉曼光譜生物成像技術及其應用[J]. 中國光學, 2013, 6(5):633-642.

ZHOU Minghui, LIAO Chunyan, REN Zhaoyu,etal. Bioimaging technologies based on surface-enhanced Raman spectroscopy and their applications[J]. Chinese Optics, 2013, 6(5):633-642.

[4] GRETA D M, SILVIA C, ELENA M,etal. Surface-enhanced Raman spectroscopy of urine for prostate cancer detection:a preliminary study[J]. Anal Bioanal Chem, 2015, 407(12):3271-3275.

[5] MELISEW T A, JYISY Y. photochemical decoration of magnetic composites with silver nanostructures for determination of creatinine in urine by surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Talanta, 2014, 130(5):55-62.

[6] MA Q, LI Y L, GONG N C,etal. Surface enhanced Raman spectroscopy sensor based on magnetic beads-induced nanoparticles aggregation for detection of bacterial deoxyribonucleic acid[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(11):1676-1681.

[7] 路雅茹, 秦勤. 血小板衍生生長因子—B與冠心病研究進展[J]. 天津醫藥, 2012, 40(5):525-527.

LU Yaru, QIN Qin. The research about the relationship between pDGF-B and coronary heart disease[J]. Tianjin Medical Journal, 2012, 40(5):525-527.

[8] 曾宇然, 王偉鴻, 盧敏, 等. 血漿透析患者血漿中血小板源性生長因子BB的表達及意義[J]. 中國實用醫刊, 2014, 41(3):4-6.

ZENG Yuran, WANG Weihong, LU Min,etal. Expression of platelet derived growth factor-BB in maintenance hemodialysis patients[J]. Chinese Journal of practical Medicine, 2014, 41(3):4-6.

[9] 趙暢, 李蓉, 楊薈楠, 等. 基于表面增強拉曼光譜檢測尿液樣本中血小板衍生生長因子—BB方法研究[J]. 中國激光, 2017, 44(08):0811002.

ZHAO Chang, LI Rong, YANG Huinan,etal. Measurement of platelet derived factor-BB in urine samples based on surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Chinese Journal of Lasers, 2017, 44(08):0811002.

[10] 王琴, 趙暢, 楊薈楠, 等. 激光拉曼光譜法同步測量液膜厚度與濃度[J]. 激光與光電子進展, 2016, 53(9):093001.

WANG Qin, ZHAO Chang, YANG Huinan,etal. Simultaneous measurement of film thickness and mass fraction by Raman spectroscopy[J]. Laser & Optoelectronics progress, 2016, 53(9):093001.

[11] CRAIG S, CLEMENTS J M, COOK A L,etal. Characterization of the structure and conformation of platelet-derived growth factor-BB and proteinase-resistant mutants of pDGF-BB expressed in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical Journal, 1992， 281(1):67-72.

[12] 章穎強, 董偉, 張冰, 等. 基于拉曼光譜和最小二乘支持向量機的橄欖油摻偽檢測方法研究[J]. 光譜學與光譜分析, 2012, 32(6):1554-1558.

ZHANG Yingqiang, DONG Wei, ZHANG Bin,etal. Research on detection method of adulterated olive oil by Raman spectroscopy and least squares support vector machine[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2012, 32(6):1554-1558.

[13] 李雷, 魏連鑫. 自適應小波閾值函數的指紋圖像去噪[J]. 上海理工大學學報, 2014, 36(02):154-157.

LI Lei, WEI Lianxin. Adaptive wavelet threshold function for fingerprint denoising[J]. Journal of University of Shanghai for Science and Technology. 2014, 36(02):154-157.

[14] 馮尚源, 潘建基, 伍嚴安, 等. 基于SERS技術結合多變量統計分析胃癌患者血漿拉曼光譜[J]. 中國科學：生命科學, 2011, 41(7):550-557.

FENG Shangyuan, pAN Jianji, WU Yanan,etal. Study on gastric cancer blood plasma based on surface-enhanced Raman spectroscopy combined with multivariate analysis[J]. Sci China Life Sci, 2011, 41(7):550-557.

[15] 郭麗. 用多元分析方法研究乳腺癌血清的SERS光譜[D]. 遼寧：大連理工大學, 2011:51-53.

GUO Li. Multivariate statistical analysis of serum from breast cancer patients using surface-enhanced Raman spectrum[D]. Liao Ning:Dalian University of Technology, 2011： 51-53.