人支氣管上皮細胞16HBE和其經硫化鎳、反式-BpDE誘導的惡性轉化細胞對脂質體轉染效率的差異性比較

夏盛源，王遠航，朱蔚云，張 嵐*

(1.廣州醫科大學-中國科學院廣州生物醫藥與健康研究所聯合生命科學學院， 廣東 廣州 511436；2.嘉興市疾病預防控制中心， 浙江 嘉興 314050)

0 引言

人類肺癌大多數起源于上皮細胞，鎳化合物和苯并(a)芘(benzoapyrene，Bap)代謝物主要作用于呼吸道上皮細胞對人形成致癌作用[1]。16HBE細胞是人的支氣管上皮細胞，通過不同的化學致癌物作用，其可發生惡性轉化，常用作肺癌疾病等相關性研究的實驗模型。人群流行病學調查和動物實驗已經證明，結晶型硫化鎳(NiS)和反式二氫二醇環氧苯并芘(anti-7, 8, -dihydrodiol-9, 10-epoxide benzo (a) pyrene，BpDE)具有惡性轉化人支氣管上皮細胞的能力，以致肺癌為主[2]。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，被稱為Ⅱ型程序性死亡，是真核細胞特有的生命現象[3-5]。我們課題組前期利用經NiS和反式-BpDE誘導的惡性轉化細胞16HBE-T1和16HBE-T2已經證明自噬途徑參與了肺上皮細胞16HBE癌變的過程，但具體的作用機制還需要進一步研究[5]。為了研究自噬途徑在肺上皮細胞癌變中的作用機制，我們利用前期建立的細胞惡性轉化模型，采用熒光顯微鏡動態細胞成像系統，通過綠色熒光質粒的轉染實驗，在無損傷狀態下實時觀測活細胞發生自噬的動態變化[6]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFp)在哺乳動物細胞表達穩定，熒光顯微鏡又容易檢測，因此GFp是常用的標記分子[7-11]。LC3是自噬體相關蛋白，LC3-Ⅱ對于自噬體的形成十分必要，有研究表明LC3-Ⅱ的數量和自噬體的數量存在一一對應的關系，因而LC3-Ⅱ被普遍認為是哺乳動物自噬體的標記物[12-14]。 GFp-LC3質粒可表達綠色熒光蛋白，將其轉染到目的細胞，表達穩定后就可用熒光顯微鏡進行活體細胞動態觀察。正常條件下，LC3在胞質內彌散分布，因此可根據GFp熒光細胞的數量和分布衡量細胞或組織的自噬行為[15-17]。在觀察GFp-LC3分布的實驗中，我們發現16HBE的轉染效率總比16HBE-T1和16HBE-T2低，這個現象引起了我們的興趣。

為了探究這個現象是否和細胞惡性轉化有關，我們在三種細胞中又轉染了可表達無特異性功能的增強型綠色熒光細胞示蹤標記蛋白的熒光質粒eGFp，并同時采用多種細胞密度進行轉染。通過兩種熒光標記，我們可以判斷是否由于質粒特異性導致轉染效率的差別；多種細胞密度轉染后的結果可以進一步證實細胞惡性轉化過程中細胞發生的變化。我們通過一系列的轉染實驗，分析其差異性原因，為探討惡性轉化細胞的癌變過程提供更直觀的細胞學證據。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人支氣管上皮細胞系16HBE、結晶型NiS誘導的16HBE惡性轉化細胞16HBE-T1和反式-BpDE誘導的16HBE惡性轉化細胞16HBE-T2來自廣州醫科大學醫學分子流行病學實驗室。

1.2 試劑及儀器

胎牛血清(FBS)，RpMI1640培養基(GIBCO)，opti-MEM培養基(GIBCO)，Lipofectamine3000 Reagent(GIBCO)，GFp-LC3和eGFp質粒(來自于廣州醫科大學醫學遺傳學與細胞生物學實驗室)，熒光顯微鏡IncuCyte Zoom長時間動態細胞成像分析系統(Essen Bioscience)。

1.3 細胞培養

16HBE、16HBE-T1和16HBE-T2三種細胞分別置于用10%FBS、100 U/mL霉素、100 mg/mL鏈霉素和RpMI1640培養基配制的完全培養液中，放入細胞培養箱。每天換液，2-3天傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞轉染

1.4.1 GFp-LC3質粒

將三種細胞接種于96孔板中，設置50%、75%和100%的細胞密度，每一種細胞按每一個密度接種兩個副孔，每一孔加入完全培養液100 μL放入37 ℃，5%CO2培養箱中培養至相應密度。轉染時，以一種細胞為例，去除每孔細胞培養液，加入100 μL opti-MEM培養基后放回培養箱待用。取一Epp管加入opti-MEM培養基40 μL和Lipofectamine3000試劑8 μL，混勻，配成A液。另取一Epp管加入opti-MEM培養基40 μL，質粒DNA 1.2 μg和p3000試劑4 μL，混勻，配成B液。將AB液充分混勻，室溫靜置10-15 min。將制備的DNA-脂質體混合液平均加入每一孔待轉染的細胞中，放回培養箱孵育6-8 h后替換為完全培養液，繼續培養12-36 h收獲細胞[18]。

1.4.2 eGFp質粒

和上述操作一致，將eGFp質粒轉染至三種細胞中。共得到兩個分別轉染了不同質粒的96孔板。

1.5 熒光顯微鏡觀察

GFp-LC3和eGFp質粒在轉染后12 h即開始在細胞內表達[19]。采用熒光顯微鏡觀察活體細胞，由于GFp為綠色熒光，顯微參數為480 nm激發波長，320 nm發射波長[20]。每一孔細胞拍攝4個視野，最后觀察比較其熒光細胞數量差異。

2 結果

2.1 用GFp-LC3質粒轉染，16HBE細胞的轉染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

在GpF-LC3的轉染實驗中，細胞之間的轉染效果呈現差異。如圖1所示，通過比較三種轉染后的細胞，我們發現惡性轉化的細胞綠色熒光分布均勻、密度大，而16HBE的熒光細胞數量明顯低于16HBE-T1和16HBE-T2。實驗結果說明正常細胞16HBE轉染GFp-LC3的效率明顯比惡性轉化細胞16HBE-T1和16HBE-T2低。

圖1 細胞密度達100% 時GFp-LC3的轉染熒光圖和透視圖Fig.1 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 100%

圖2 細胞密度達100% 時eGFp的轉染熒光圖和透視圖Fig.2 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 100%

2.2 用eGFp質粒轉染，16HBE細胞的轉染效率比16HBE-T1和16HBE-T2低

為了探討三種細胞轉染效率的差別是否因為GFp-LC3質粒的特異性而造成的，我們還轉染了另一種質粒eGFp做比較。結果發現，如圖2所示，16HBE的熒光細胞數量仍然明顯低于16HBE-T1和16HBE-T2。此實驗結果說明，正常細胞16HBE轉染eGFp質粒的效率低于惡性轉化細胞16HBE-T1和16HBE-T2；轉染質粒種類的差異不是造成這三種細胞轉染效率差異的原因。

2.3 不同細胞密度的轉染實驗

由于有些細胞在不同密度下的轉染效率差別較大，因此為了探究造成三種細胞轉染效率的差異是否由于轉染時細胞密度的原因，我們又設置了另外兩個細胞密度的轉染實驗。從實驗結果來看，如圖1、圖3和圖 4，圖2、圖5和圖6所示，不僅細胞與細胞之間，每一種細胞在不同細胞密度時的轉染效率也是有差異的。橫向比較在50%、75%和100%的細胞密度的轉染效率，我們發現每一種細胞均在細胞密度大概為75%時的轉染效率是最高的。但與此同時，16HBE的熒光細胞數量都是少于16HBE-T1和16HBE-T1。因此，該實驗結果說明細胞密度并不是造成三種細胞轉染效率差異的原因。

圖3 細胞密度達50% 時GFp-LC3的轉染熒光圖和透視圖Fig.3 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

圖4 細胞密度達75% 時GFp-LC3的轉染熒光圖和透視圖Fig.4 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with GFp-LC3 when the cell abundance is 75%

圖5 細胞密度達50%時eGFp的轉染熒光圖和透視圖Fig.5 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 50%

圖6 細胞密度達75%時eGFp的轉染熒光圖和透視圖Fig.6 Transfection fluoroscopy and scenograph of cell which is transferred with eGFp when the cell abundance is 75%

3 討論

細胞轉染實驗目前在研究基因功能、調控基因表達和蛋白質生產等生物學實驗中應用非常廣泛，是實驗室中很常用和有效的實驗研究方法。陽離子脂質體是目前轉染效率最高，且細胞毒性最小的非病毒基因載體之一。其轉染效率與脂質體成成份、脂質體與質粒DNA的比例、細胞狀態、轉染時間以及靶細胞的選擇性作用有關[21]。

目前，研究自噬的定量分析方法多使用GFp-LC3法，即通過轉染可表達GFp-LC3融合蛋白的質粒，使LC3攜帶有綠色熒光，從而可通過熒光顯微鏡觀察細胞內LC3的定位和分布[22]。因此，我們想通過熒光蛋白質粒的瞬時轉染來觀察細胞自噬的情況。在此過程中，我們意外發現了正常細胞和惡性轉化細胞在平行條件下的轉染效率差異，由此進行了兩組轉染實驗。eGFp增強型綠色熒光蛋白是一種優化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型強35倍，具有結構穩定、高效表達、無種系依賴性等特點，更適用于細胞基因表達和蛋白定位檢測及細胞示蹤標記[23]。在利用GFp-LC3和eGFp質粒分別對三種細胞進行轉染的實驗中，結果發現無論是GFp-LC3還是eGFp，正常細胞的轉染效率都低于惡性轉化細胞，這就排除了質粒本身造成此差異的原因。為此，我們還嘗試比較了在多種細胞密度下，各種細胞的轉染效率是否還存在差異性。實驗結果證實在不同的細胞密度下，正常細胞的轉染效率仍然低于惡性轉化細胞。

綜上所述，本研究發現在利用脂質體法轉染正常細胞和惡性轉化細胞的實驗中，質粒的種類差異和轉染時的細胞密度都不是造成它們轉染效率差異性的原因。為此，我們猜測是由于惡性轉化細胞在癌變過程中發生了細胞膜通透性的改變，從而導致了在轉染過程中，細胞吸收外源質粒的程度不一樣。但是要明確細胞膜通透性影響轉染效率的具體作用機制，需要我們進一步的研究。

[1] 劉莉莉, 陳家堃, 黃建勛, 等. 結晶型硫化鎳及反式-BpDE惡性轉化16HBE細胞hMSH2基因甲基化的研究[J]. 毒理學雜志, 2008, 22(06):416-420.

LIU Lili, CHEN Jiafang, HUANG Jianxun,etal. Aberrant methylation of the hMSH2 gene in the Nis and anti-BpDE-transformed 16HBE cells[J]. Journal of Toxicology, 2008, 22(06):416-420.

[2] 王全凱, 王博深, 謝廣云, 等. GMA誘導16HBE惡性轉化細胞中LncRNA EMX2OS的表達及意義[J]. 癌變·畸變·突變, 2017, 29(06):422-426.

WANG Quankai, WANG Boshen, XIE Guangyun,etal. Expression of LncRNA EMX2OS during glycidyl methacrylate-induced malignant transformation of 16HBE cells[J]. Carcinogenesis, Teratogenesis & Mutagenesis, 2017, 29(06):422-426.

[3] NI H, BOCKUS A, WOZNIAK A L,etal. Dissecting the dynamic turnover of GFp-LC3 in the autolysosome[J]. Autophagy, 2014, 7(2):188-204.

[4] HUANG D, YANG L, LIU Y,etal. Functional polymorphisms in NFkappaB1/IkappaBalpha predict risks of chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer in chinese[J]. Hum Genet, 2013, 132(4):451-460.

[5] 張嵐, 楊磊, 呂嘉春. 結晶型硫化鎳通過自噬途徑誘導16HBE細胞惡性轉化癌變[J]. 基因組學與應用生物學, 2012, 31(03):222-225.

ZHANG Lan, YANG Lei, LV Jiachun. Crystalline nickel sulfide induced malignant transformation of 16HBE cells through autophagic pathway[J]. Genomics & Applied Biology, 2012, 31(03):222-225.

[7] CIECHOMSKA I A, TOLKOVSKY A M. Non-autophagic GFp-LC3 puncta induced by saponin and other detergents[J]. Autophagy, 2007, 3(6):586-590.

[8] KUMA A, MIZUSHIMA N. Chromosomal mapping of the GFp-LC3 transgene in GFp-LC3 mice[J]. Autophagy, 2008, 4(1):61-62.

[9] WACKER R, EICKEL N, SCHMUCKLI MAURER J,etal. LC3‐association with the parasitophorous vacuole membrane of plasmodium berghei liver stages follows a noncanonical autophagy pathway[J]. Cellular Microbiology, 2017, 19(10):1-13.

[10] BRAVO-SAN p J, pIETROCOLA F, SICA V,etal. High-throughput quantification of GFp-LC3(+) dots by automated fluorescence microscopy[J]. Methods Enzymol, 2017, 587:71-86.

[11] MIZUSHIMA N, KUMA A. Autophagosomes in GFp-LC3 Transgenic Mice[J]. Methods Mol Biol, 2008, 445(1):119-124.

[12] ADISESHAIAH p p, SKOCZEN S L, RODRIGUEZ J C,etal. Autophagy monitoring assay II:imaging autophagy induction in LLC-pK1 cells using GFp-LC3 protein fusion construct[J]. Methods Mol Biol, 2018, 1682(1):211-219.

[13] NI H M, BOCKUS A, WOZNIAK A L,etal. Dissecting the dynamic turnover of GFp-LC3 in the autolysosome[J]. Autophagy, 2011, 7(2):188-204.

[14] pUGSLEY H R. Quantifying autophagy:measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry[J]. Methods, 2017, 112:147-156.

[15] MAUVEZIN C, ORpINELL M, FRANCIS V A,etal. The nuclear cofactor DOR regulates autophagy in mammalian and Drosophila cells[J]. EMBO Rep, 2010, 11(1):37-44.

[16] GONG C, BAUVY C, TONELLI G,etal. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells[J]. Oncogene, 2013, 32(18):2261-2272, 2271e-2272e.

[17] 李建國, 范睿, 蔡亞非. 慢病毒GFp質粒的構建及脂質體介導雞胚細胞中瞬時表達動力學初步研究[J]. 激光生物學報, 2008, 17(05):593-598.

LI Jianguo, FAN Rui, CAI Yafei. A primary study on the constructed GFp lentvirus vectors transient expression kinetics in the chicken embryo cells by liposome mediating[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2008, 17(05):593-598.

[18] 王遠航, 夏盛源, 張嵐. Becn1通過線粒體凋亡途徑參與調控肺癌細胞的凋亡過程[J]. 激光生物學報, 2017, 26(02):138-142.

WANG Yuanhang, XIA Shengyuan, ZHANG Lan. Becn1 regulates cell apoptosis of lung cancer by mitochondrial apoptosis pathway [J]. Acta Laser Biology Sinica, 2017, 26(02):138-142.

[19] 張禾璇, 單可人, 何燕, 等. 脂質體法與電穿孔法轉染兩種細胞效率的比較[J]. 重慶醫學, 2014, 43(33):4432-4433.

ZHANG Hexuan, SHAN Keren, HE Yan,etal. Comparison of transfection efficiency of two kinds of cells by lipofection and electroporation[J]. Chongqing Medicine, 2014, 43(33):4432-4433.

[20] 馬百超, 張樹彪, 王冰, 等. 細胞種類對陽離子脂質體介導基因轉染的影響[J]. 安徽農業科學, 2008, 36(14):5779-5781.

MA Baichao, ZHANG Shubiao, WANG Bing,etal. Effects of cell types on gene transfection mediated by cationic liposome[J]. Journal of Anhui Agri, 2008, 36(14):5779-5781.

[21] 黃楨鈞, 劉彬, 劉本榮, 等. 雙熒光mRFp-eGFp-LC3體系在細胞自噬中的作用[J]. 貴陽醫學院學報, 2015, 40(10):1029-1032.

HUANG Zhenjun, LIU Bin, LIU Benrong, Evaluating the effect of dual-fluorescence mRFp-eGFp-LC3 in autophagy[J]. Journal of Guiyang Medical College, 2015, 40(10):1029-1032.

[22] 劉萍, 鄭慧玲, 吳建偉, 等. 綠色熒光蛋白在貴陽腐霉的組成性表達[J]. 湖北農業科學, 2012, 51(24):5801-5803.

LIU ping, ZHENG Huiling, WU Jianwei,etal. Constitutive expression of green fluorescent protein gene in pythium guiyangense, 2012, 51(24):5801-5803.