樣品不同稀釋倍數的菌落總數檢測分析

高 杰

(國家城市供水水質監測網武漢監測站，湖北 武漢 430000)

飲用水國標GB/T 5750.12-2006定義菌落總數是指水樣在營養瓊脂上有氧條件下37℃培養48 h后，所得1 mL水樣所含菌落的總數[2]。水中的細菌學檢查是評判水質優劣的重要指標，作為日常檢測七項指標(色度、濁度、嗅和味、肉眼可見物、菌落總數、總大腸菌群、pH值)之一的菌落總數，主要反映了水體的受污染程度以及評價水處理工藝是否達標的主要因素。

在實際工作中檢測人員經常會參加微生物盲樣考核，能夠快速提升自身的技術水平[3]，可以對欠缺的理論知識進行查漏補缺，充分保證測定數據達到確定的檢驗質量標準[4]。進行菌落總數考核時，檢測人員要面臨如何確定稀釋倍數這一主要問題。本文通過對已知菌落總數的標準樣品進行不同梯度的稀釋，分析不同稀釋倍數樣品之間的數據差異，對今后的微生物考核能夠提供一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

營養瓊脂，標準樣品(濃度范圍146±19cfu/mL)。

1.2 實驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養箱，無菌移液管，無菌取樣瓶，9cm玻璃平皿。

1.3 實驗步驟

1.3.1 標準樣品前處理

將標準樣品管從冰箱中取出，置于室溫平衡10～15min。將100 mL無菌緩沖液(PBS)倒入100mL無菌取樣瓶中定量。把管中有顏色的圓形膠盤無菌操作轉移至100 mL無菌PBS中(必要時可使用無菌鑷子，一定要在鑷子冷卻后夾取膠盤)。充分振蕩后靜置10min，直到圓形膠盤完全溶解，得到待檢測標準原液(使用前要充分搖勻)。

1.3.2 平皿計數法

為保證數據的充分可靠性，設計了4個稀釋梯度，分別是1倍、2倍、5倍、10倍的稀釋液：

1)1倍稀釋液是標準原液；無菌操作方法吸取20 mL充分混勻的標準原液，注入盛有20 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成2×稀釋液；無菌操作方法吸取20 mL充分混勻的標準原液，注入盛有80 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成5×稀釋液；無菌操作方法吸取10 mL充分混勻的標準原液，注入盛有90 mL滅菌水的無菌瓶中，混勻成10×稀釋液；

2)以無菌操作方法分別吸取1mL不同稀釋倍數的樣品，吸取樣品前要充分混勻，注入到玻璃平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻；

3)待培養基冷卻凝固后，翻轉平皿，置于(36±1)℃恒溫培養箱內培養48 h，分別進行菌落計數。

2 結果與討論

2.1 十組平行實驗數據

將每一個稀釋樣品做10組平行樣，分析表1和圖1的數據發現，1×標準原液和2×稀釋樣品的菌落總數分布相對集中，平均值也都在合理范圍。隨著稀釋倍數越來越高，樣品的菌落總數分布越來越離散，其中5×和10×的稀釋樣品平均值不在允許濃度范圍內。當樣品被稀釋的倍數變大時，那么每一次取樣的均勻性就會越來越低，導致偏差較大。

表1 各稀釋樣品的菌落總數

圖1 各稀釋樣品菌落總數散點圖

2.2 二十組平行實驗數據

將每一個稀釋樣品再做20組平行樣，分析表2和圖2的數據發現，1×標準原液和2×稀釋樣品的菌落總數分布情況與圖1類似，2×稀釋樣品的平均值更加接近中位值146cuf/mL。通過增加樣品量，5×稀釋樣品的菌落總數平均值落在合理范圍內。但是10×稀釋樣品的菌落總數依然不在有效范圍內，這是因為該標準樣品菌落總數的確定范圍是(146±19)cfu/mL，如果稀釋到10倍，誤差就會變大，數據間的差值也會很不均衡。通過增加平行樣數量，可以使結果更加精準，但是如果稀釋倍數過高，那么就需要更多的樣本量，才可能使結果準確，不過這會導致實際實驗中效率下降，精力耗費過大。

表2 各稀釋樣品的菌落總數

圖2 各稀釋樣品菌落總數散點圖

2.3 討論

在實際考核中，一般情況下質控考核作業指導書會標明菌落總數盲樣的濃度范圍，那么在確定稀釋倍數時，檢測人員應該盡可能的把稀釋后的樣品菌落總數落在300cfu/mL范圍內，這樣可以使菌落在9 cm玻璃平皿上最大化的均勻分布，還能夠保證最有效的稀釋倍數；如果質控考核作業指導書沒有給出菌落總數濃度范圍，那么檢測人員就要根據實際情況制定一系列的稀釋梯度，而且對于稀釋度高的樣品要做至少20組的平行實驗，以此來保證數據的可靠性。不管是否提供濃度范圍，實驗中都要保證每一個稀釋度都有比較充足的樣本量，低倍稀釋樣品可以有所縮減，以此來提高實驗效率和準確度。

[1]王虹玲. 微生物質控考核盲樣未知菌檢測方法探討[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2000(5): 603.

[2]劉玉紅,景二丹,胡興利, 等. 酶底物法與平皿計數法測定水中菌落總數的比較[J]. 中國給水排水, 2017(2): 111-114.

[3]楊獻青,何惠娟. 微生物質控盲樣菌株鑒定的檢驗思路與質量保證[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2010(3): 663-664.

[4]王云國,李懷燕. 食品微生物檢驗內容及檢測技術[J]. 糧油食品科技, 2010(3): 40-43.