油桐粕蛋白降解菌的篩選鑒定及固態發酵研究

趙夢瑞 方勤敏 黎繼烈 李培旺 張夢君肖志紅 李昌珠 吳 紅 談泰猛 彭映暉

(經濟林培育與保護教育部重點實驗室；中南林業科技大學1，長沙 410004) (湖南省林業科學院2，長沙 410004)

油桐是我國本土木本油料樹種，歷史悠久。油桐具有生長快，產量高，適應性廣，種子含油率高且營養豐富等優點[1-2]。桐籽榨油后的主要副產物桐粕，含有蛋白質36.3%～45%(浸出法)，是一種優良的植物蛋白資源， 還有豐富的大量元素如P2O51.8%～2.7%，K2O 1.2%～1.3%，以及多種微量元素[3]。黃誠[4]研究發現油桐粕中有皂角甙和佛波醇及其相關化學物質兩種毒素，因此其飼用受到限制，長久以來多作為餅肥還田使用。油桐粕作農用肥肥效高且持久，有助于改良土壤的理化性質，能夠在一定程度上規避對于化學肥料的依賴。但是經傳統堆肥后施用，餅粕中大分子蛋白質降解時間長，存在著餅肥不符合植株生長相應的氮素供需規律、蛋白質等營養物質利用率低的問題[5-6]。相對于已有的一些改善大分子蛋白質營養結構的化學法和物理法，微生物發酵法具有消耗少，產率高，易操作和大規模生產等優勢，成為目前解決這個問題一種有效方法。而微生物發酵的關鍵在于優勢菌種的選育。但是目前關于油桐粕肥源化的研究和成果還比較少。方亭亭等[7]研究桐籽餅粕蛋白降解菌，篩選到三株對桐籽餅粕粗蛋白均表現出較強降解能力的白色短小桿菌B.licheniformis、地衣芽孢桿菌B.licheniformis和肉葡萄球菌C.albidum，但是并未對三株細菌進行深入探究。本研究從自然發酵的油桐粕堆肥中，分離篩選能夠耐受桐粕毒素并高效降解油桐粕蛋白的菌株，從形態學、生理生化和分子生物學水平，分析確定該菌株系統發育地位，研究其固態發酵油桐粕的最佳工藝參數，為提高油桐粕蛋白的營養和應用價值，以及油桐粕的肥源化再利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

供試油桐餅粕：湖南國盛生物能源股份有限公司，測得該餅粕中蛋白質含量為28.6%，含油率為7.2%，含水量為6.3%。

1.1.2 培養基

NA培養基[8]用于細菌的分離培養；油桐粕浸出汁培養基：油桐粕200 g，60～90 ℃下浸泡3～4 h，用8層紗布過濾除去殘渣獲得桐粕汁，定容至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min，用于菌株的初篩；油桐餅粕發酵底料：油桐餅粕和水按質量比等比例混勻，500 mL錐形瓶裝量40 g，121 ℃滅菌20 min，滅菌2次，用于菌株的復篩。

1.2 主要試劑與儀器

細菌DNA提取試劑盒、DNA maker、dNTP、DNA聚合酶等：寶生物工程(大連)有限公司；其余試劑均為國產分析純。超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；PCR儀、凝膠成像儀：美國ABI公司；電泳儀：北京六一儀器廠；恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；K06C全自動凱氏定氮儀：上海晟聲自動化分析儀器有限公司；DIONEX P680高效液相色譜：美國戴安公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 評估指標及其測定方法

粗蛋白百分含量和總蛋白氮含量的測定采用凱氏定氮法[9]：粗蛋白含量=蛋白氮含量×6.25。

氨基態氮的測定采用甲醛法[10-11]：精確稱取油桐餅粕5 g于250 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水。電爐加熱煮沸2～3 min。冷卻至室溫，上清液轉移定容至50 mL容量瓶，吸取10 mL 上清液，使用pH計調至8.20后加入甲醛溶液10 mL，用0.5 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至9.20為終點，記下消耗氫氧化鈉體積并計算氨基態氮含量。同時做試劑空白實驗，計算方法如下：

式中：Y為氨基態氮含量(以氮計)/mg/g；V0為樣品加入甲醛后用去氫氧化鈉標準溶液數/mL；V為試劑空白加入甲醛后好用氫氧化鈉標準溶液數/mL；Vl為吸取稀釋液數/mL；N為NaOH標準溶液的濃度/mol/L；0.014為消耗1 mL NaOH標準溶液相當氮的毫克當量/g。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 菌株的分離與初篩

取10 g自然堆積發酵的油桐餅粕接種到裝有90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、180r/min下搖床培養24 h，然后吸取1 mL懸浮液，用無菌水進行系列梯度稀釋。分別吸取100 μL稀釋懸浮液(10-8～10-10)涂布至NA平板上，每個濃度重復3次。將平板置于30 ℃恒溫培養箱中倒置培養36 h，然后挑選形態各異的菌落進行劃線純化處理，并對其進行編號，保存于4 ℃下備用。

將分離得到的菌株分別接種至裝有50 mL NA液體培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180 r/min下恒溫搖床培養24 h，用無菌水調整菌液濃度至108CFU/mL[12-13]，吸取5 mL菌液接種到裝有50 mL油桐粕浸出汁培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180r/min下恒溫搖床培養72 h，然后吸取1 mL懸浮液，用無菌水進行系列梯度稀釋。分別吸取100 μL稀釋懸浮液涂布至NA平板上，每個濃度重復3次。將平板置于30 ℃恒溫培養箱中倒置培養36 h，采用稀釋平板法對候選菌株進行計數[14]，選擇生長狀況較好的菌株，保存于4 ℃下備用。

1.3.2.2 菌株的復篩

將初篩得到的候選菌株分別接種至裝有50 mL NA液體培養基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180r/min下恒溫搖床培養24 h，用無菌水調整菌液濃度至108CFU/mL[12-13]，按40%(V/m)的接種量接種菌液至油桐粕發酵底料中，在30 ℃恒溫培養箱培養4 d，每隔24 h進行翻樣，每個菌株3組重復。發酵結束后，取出發酵物并在70 ℃下進行烘干處理，測定發酵前后樣品中氨基態氮含量，對比實驗結果篩選出發酵效果比較好的菌株，進行后續的實驗研究。

1.3.3 候選菌株的鑒定

形態學觀察：將篩選得到的菌株劃線接種至NA培養基上，30 ℃條件下培養24 h，觀察菌落生長形態，并進行常規的革蘭氏染色。

生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行菌株生理生化特征鑒定。

16S rRNA基因序列分析：利用細菌DNA提取試劑盒提取候選菌株DNA，采用細菌擴增通用引物[15]16SF和16SR擴增細菌的16S rRNA；PCR反應體系(50 μL)為10×PCR buffer 5 μL，DNA模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，引物(1 mmol/L)各 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O 至50 μL；反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環，4 ℃ 保存。擴增產物由上海生工生物工程有限公司進行測序，將測定的序列在GenBank中進行BLAST相似性比對，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構建系統發育樹，確定候選菌株的系統發育學地位。

1.3.4 候選菌株固態發酵優化

1.3.4.1 種子液培養

將候選菌株接種至 NA液體培養基中，30 ℃、180 r/min下恒溫搖床培養24 h，作為發酵種子液備用。

1.3.4.2 接種量選擇

對接種量(5%、10%、20%、30%、40%、50%)進行單因素實驗，發酵培養基中50%初始含水量，初始pH自然，溫度為35 ℃，時間4 d，每隔24 h進行翻樣，每個處理重復3次。發酵優化效果的評價以底物中氨基態氮含量為指標，測定方法同1.3.2。

1.3.4.3 發酵溫度選擇

對溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)進行單因素實驗，選擇最優接種量，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.4.4 初始含水量選擇

對初始含水量(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%)進行單因素實驗，選擇最優溫度和接種量，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.4.5 發酵時間選擇

對發酵時間(2、3、4、5、6、7、8 d)進行單因素實驗，選擇最優接種量、初始含水量和溫度，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.5 發酵前后游離氨基酸成分及含量檢測

采用高效液相色譜法對油桐餅粕及其在最優發酵條件下的發酵產物進行游離氨基酸組成和含量的測定，參照劉躍芹等[16]建立的測定方法和GB 5009.124—2016，并對產物中氨基酸的變化進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與篩選

2.1.1 菌株的初篩

通過稀釋平板涂布法從堆積發酵的油桐餅粕中分離到12株細菌；初篩結果見表1，有7株細菌在培養72 h后的生物量較高，分別為LYT-1、LYT-2、LYT-3、LYT-4、LYT-5、LYT-8和LYT-9，其中，菌株LYT-1的生物量最高，達到(2.67±0.22)×107CFU/mL，這可能與細菌自身的生長和代謝水平受桐粕浸出汁中營養成分和有毒物質的影響有關。因此，選取初篩得到的7株細菌進行進一步的發酵復篩。

表1 分離菌株的生物量差異情況

2.1.2 菌株的復篩

對初篩得到的菌株進行發酵復篩，桐粕中氨基態氮含量變化如圖1所示，在相同的發酵條件下，7株菌株發酵后底物中氨基態氮含量均有提高，其中LYT-1菌株發酵效果最好，氨基態氮含量達到19.3 mg/g，增長了11.1倍，因此選取發酵效果較好的LYT-1菌株進行下一步的研究工作。

圖1 油桐餅粕發酵前后的氨基態氮含量

2.2 候選菌株的鑒定

2.2.1 形態學特征

LYT-1菌株在NA平板上30 ℃培養24 h，菌落形態見圖2a，呈污白色，圓形和橢圓，表面粗糙、有突起，且不透明，菌落直徑約(5.5±0.5) mm；革蘭氏染色呈陽性，見圖2b，為革蘭氏陽性菌；芽孢染色顯示有芽孢生成，見圖2c。

圖2 菌株LYT-1的形態學特征

2.2.2 生理生化特征

LYT-1菌株的部分生理生化特征測定結果如表2所示，該菌株能夠降解無機磷和纖維素，明膠液化和硝酸鹽還原反應結果呈陽性，但對產氨實驗和產吲哚實驗的結果均為陰性。

表2 生理生化特征

注：“+”代表反應為陽性，“-”代表反應為陰性。

2.2.3 16S rRNA基因分子鑒定

經DNA提取，PCR擴增和測序獲得的16S rRNA基因的片段大小為1 327 bp。在GenBank上進行BLAST比對，結果顯示菌株LYT-1與枯草芽孢桿菌序列相似性達到 99%。從GenBank中分別調取芽孢桿菌屬不同種的11株標準菌株的16S rRNA基因序列，構建系統發育樹(圖3)，菌株LYT-1與枯草芽孢桿菌的親源關系最近，提交序列后獲得登錄號為KY626046。結合形態學、生理生化特征鑒定和16S rRNA序列分析結果，確定菌株LYT-1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 基于16S rRNA基因序列相似性構建的
菌株LYT-1的系統發育樹

2.3 菌株固態發酵條件的優化

2.3.1 最佳接種量和發酵溫度的確定

由圖4可知，當接種量在30%時，油桐粕發酵后氨基態氮含量最高，達到30.0 mg/g；在接種量30%條件下，當發酵溫度為45 ℃時，油桐粕發酵后氨基態氮含量最高，達到33.7 mg/g。因此初步確定最佳接種量和發酵溫度分別為30%和45 ℃。

圖4 最佳發酵溫度和接種量的確定

2.3.2 最佳初始含水量和發酵時間的確定

由圖5可知，在接種量30%、發酵溫度45 ℃條件下，初始含水量為60%時，油桐粕發酵后氨基態氮含量最高，達到36.3 mg/g；在接種量30%、發酵溫度45 ℃、初始含水量60%條件下，發酵時間為7 d時，油桐粕發酵產物中氨基態氮含量最高，達到40.6 mg/g，對比發酵前具有顯著提高。

圖5 最佳初始含水量和發酵時間的確定

2.4 油桐粕發酵前與其發酵產物中的游離氨基酸分析

樣品中檢測到17種氨基酸組份見表3，由檢測結果可知，固態發酵優化后游離氨基酸總含量顯著增加，相比發酵前提高了24.5倍。各種氨基酸的含量也均有增加，其中谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的含量增幅較大。

表3 游離氨基酸的組成及含量

3 討論

綠色有機肥是未來生態農業持續發展的重要方向。高氮、磷、鉀含量的油桐粕是一種可開發利用的優良植物肥料基質。本研究從自然發酵的油桐粕堆肥中篩選得到1株降解油桐粕蛋白效果較好的的枯草芽孢桿菌LYT-1，探究了初始含水量、接種量、發酵溫度和時間對該菌株發酵效果的影響，發現不同發酵條件下發酵效果具有差異性。通過對發酵條件進行優化，結果顯示優化后桐粕發酵產物中氨基態氮含量顯著提高。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類革蘭氏陽性桿狀好氧型細菌，可以產生內生芽孢，其適應能力強，應用性廣，沒有致病性，對環境和人畜無害，是我國農業部批準使用的一種允許使用且可以直接飼喂動物的益生菌[17]。枯草芽孢桿菌可產生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多種消化酶，在形成芽孢過程中可分泌多種抗生素，因此，枯草芽孢桿菌是一種理想的生物有機肥發酵菌種。由于枯草芽孢桿菌自身的優良特性，近年來引起了人們的廣泛關注。本研究篩選到的枯草芽孢桿菌LYT-1，能夠有效降解油桐粕中大分子蛋白質為易被植物吸收利用的氨基酸和小肽類物質的同時還具有解磷和降解纖維素的能力。將其用于生物有機肥的制備，既能降解餅粕中纖維素從而提高還原糖含量，又可以幫助分解土壤中的無機磷以促進作物的生長，從而提高桐粕肥的營養價值。因此，枯草芽孢桿菌LYT-1在油桐粕肥及其他生物肥的發酵生產中都有很好的開發和應用前景。該菌株的其他特性以及在生產上的應用效果有待進一步的研究。

4 結論

4.1 以自然發酵的油桐粕堆肥為菌種來源，通過稀釋平板涂布法和劃線分離法篩選到1株高效降解油桐粕蛋白的細菌LYT-1。通過進行形態學、生理生化和16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4.2 對該菌株固態發酵油桐粕的培養條件進行優化，以氨基態氮含量為評價指標，得到最佳條件為：接種量30%、初始含水量60%、發酵溫度45 ℃、發酵時間7 d。在此發酵條件下，氨基態氮含量達到40.6 mg/g，是優化前氨基態氮含量的2.1倍，比發酵前提高了24.6倍。

4.3 檢測發酵優化前后油桐粕中游離氨基酸成分和含量，發現優化后游離氨基酸總量顯著增加，較之前提高了24.5倍，表明用枯草芽孢桿菌LYT-1發酵能夠有效地降解油桐粕蛋白并改善其營養結構。