鄰甲酚酞褪色分光光度法定量測定γ-環糊精含量

張 昊 張 毅 程博聞 王攀磊 田 云

(天津工業大學紡織學院1，天津 300387) (天津工業大學；改性與功能纖維天津市重點實驗室2，天津 300387)

環糊精(cyclodextrin，簡稱CD)是由環糊精葡萄糖基轉移酶催化淀粉或其相關的物質所得到的環狀化合物，最常見的有α-CD、β-CD、γ-CD 3種, 分別由6、7、8 個葡萄糖殘基通過α-1, 4 糖苷鍵連接而成。環糊精外親水、環內疏水的性質使其能與各種有機物作用形成穩定的復合物，改變有機物的某些性質，從而在食品、醫藥、農業、化工等領域都具有廣泛的用途[1-6]。在這3種環糊精中，γ-環糊精內腔最大，具有更廣泛的包埋客體分子的能力，并且其較高的水溶性、突出的乳化特性和安全性，使其在食品、制藥和化妝品等領域具有很大的應用空間[7-9]。故建立一種簡便快速測定產品含量的方法，對實現γ-環糊精的工業化生產和應用具有重要意義。

目前CD的測定方法有熒光分析法、旋光度法、還原糖測定法以及高效液相色譜法等，各有優缺點。熒光分析法是分析目前生物大分子的常用分析手段之一，但由于包括環糊精在內的多糖類物質本身并無熒光基團，故需要采用昂貴的衍生化試劑對環糊精進行熒光化，測定成本較高，步驟煩瑣，且重復性較低[10-11]。比旋光度法主要采用一些自身無旋光性的物質作為探劑，利用其與環糊精形成包絡后引起后者旋光度變化值來間接測定環糊精含量，該方法測試靈敏較低，且由于環糊精的高旋光性，除探劑之外的其他因素如pH、溫度、甚至環糊精濃度等均可引起旋光度的變化，測定結果不穩定，易受干擾，只能作為一種輔助分析手段[12]。還原糖法同樣是多糖及寡糖類的常用定量方法，其原理是通過將樣品酶解后測定酶解液中還原糖含量來對樣品定量。其優點是反應靈敏，線性關系良好，缺點是缺少專一性，由于所有糖類物質對此方法均有相應，故如樣品中含有的葡萄糖及淀粉等成分會影響測定結果[13]。高效液相色譜(HPLC)法結果準確，精度高，且專一性強，但需要昂貴的色譜儀，對實驗人員的要求也較高，且用時較長，難以廣泛使用[14-16]。相比較而言，分光光度法具有儀器簡單，操作容易，測定快速等優點，且在一定條件下其測定結果與HPLC法相近，故較適于CD的一般生產和使用單位采用[17-18]。

有關γ-CD 的分光光度法測定，國內外報道較少，僅Kato等[19]及劉虹等[20]有過研究。Tako首先以溴甲酚綠(BCG)為指示劑，利用BCG與γ-CD形成包絡物后增色的原理，建立了γ-CD 的分光光度測定方法。國內的劉虹等在此基礎上通過優化工藝，對該法進行了完善。但以BCG為指示劑的γ-CD測定方法尚存在不足。首先，BCG對γ-CD的增色機理尚不明確；其次，受BCG指示劑變色范圍的影響，此法需在酸性環境中測定，由于環糊精不耐酸的特性，在酸性中極易分解，從而影響了此法測定結果的準確性[21]。

由此可見，在γ-CD的分光光度測定中，探劑的選擇尤為重要。本文首次發現γ-CD 與鄰甲酚酞分子包絡后會顯著降低后者的吸光值，即γ-CD對鄰甲酚酞溶液具有顯著的褪色效應。且其吸光度減小值與γ-CD濃度在一定范圍內呈線性關系，符合朗伯—比爾定律。此外，與溴甲酚綠不同的是，由于鄰甲酚酞探劑分子與γ-CD包絡并褪色的pH條件為弱堿性(pH=9～10)，而在此條件下環糊精結構比較穩定，故而在最大程度上避免了因樣品的分解對測定結果的影響，使測定的準確性與穩定性方面得到必要的保障。基于此，本研究建立了以鄰甲酚酞為指示劑的γ-CD含量分光光度測定方法，同時就各參數對測定的影響進行了討論，優化了測定方法，并對測定結果的準確性、重復性進行了深入分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料

γ-環糊精(γ-CD)：德國瓦克化學試劑有限公司，分析純；鄰甲酚酞(OCP)：上海恒遠生物科技有限公司，分析純。

1.2 主要儀器與設備

島津2600紫外可見光分光光度計：日本島津公司：Waters 1525高效液相色譜儀：美國沃特世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

鄰甲酚酞溶液：以90%乙醇溶液配制4.2 mmol/L OCP母液，使用時再以20%乙醇溶液稀釋配制成所需濃度溶液；pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液：由0.1 mol/L碳酸鈉與0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液配制并以酸度計校準；γ-CD標準儲備液：準確稱取一定質量γ-CD，以去離子水配制成25 mmol/L的γ-CD標準儲備液100 mL。使用時，再以去離子水稀釋制成所需濃度的γ-CD待測樣品溶液。

1.3.2 γ-CD的分光光度測定方法

吸光度差值△A的測定：取一定濃度OCP溶液3 mL 加入比色管中，隨后加入一定濃度的γ-CD溶液3 mL，以pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液定容至25 mL并混勻。于30℃恒溫水浴中靜置15 min后，在567 nm處以緩沖溶液為參比測定其吸光度。在空白實驗中，以3 mL蒸餾水替代γ-CD溶液，其余實驗操作相同。

吸光度差值(△A)=空白溶液吸光度(A′)-樣品溶液吸光度(A)

γ-CD標準曲線的繪制：取一定濃度的OCP溶液3 mL分別加入數個比色管中，隨后依次在各管中加入濃度為1.5、3、4.5、6、7.5、9 mmol/L的γ-CD溶液3 mL，以pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液將各管定容至25 mL并混勻。于30 ℃恒溫水浴中靜置15 min后，在567 nm處以緩沖溶液為參比測定其吸光度。在空白實驗中，以3 mL蒸餾水替代γ-CD溶液，其余實驗操作相同。以γ-CD濃度為橫坐標，被測樣品溶液與空白溶液吸光度差△A為縱坐標作圖，得到一正相關曲線，作為 γ-CD 標準曲線。

此方法的檢出限采用式(1)計算[22]：

(1)

式中：DL為檢出限/mmol/L；K′為根據一定置信水平確定的系數，IUPAC建議取3；Sh為空白多次測得信號的標準偏差(至少20次)；k為方法的靈敏度, 即標準曲線的斜率。

計算此方法中OCP-(γ-CD)包絡物的摩爾吸光系數采用式(2)計算[23]：

(2)

1.3.3 γ-CD的HPLC測定方法

準確稱取一定量γ-CD與去離子水配制成10 mmol/L 的標準溶液，隨后以去離子水分別稀釋成5、4、3、2、1、0.5 mmol/L標準溶液，分別以50 μL的進樣量注入Waters 1525高效液相色譜儀，根據峰面積和濃度繪制標準曲線。色譜條件為：色譜柱：Aqueous Column 2.5 μm 150×4.6 mm；流動相：甲醇：水(5∶95)；流速：1.0 mL/min；進樣量：50μL；柱溫：40 ℃。隨后配制濃度為4.5 mmol/L的γ-CD待測樣品溶液，以相同的色譜條件進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 鄰甲酚酞褪色原理

鄰甲酚酞(簡稱OCP)又稱鄰甲苯酚酞，與酚酞具有相近的化學結構及理化性質，其變色范圍為8.2～9.8，其酸式結構為無色的內酯形式，堿式結構為醌式而顯紅色。γ-CD使OCP褪色的原理可如圖1所示。當OCP分子處于變色pH范圍內時，結構不穩定，容易發生重排，在與γ-CD形成包絡物后，部分OCP中心碳原子由原來的sp2雜化轉化為以sp3雜化軌道成鍵，其結構發生了由醌式向內酯形式的轉變，從而阻礙了三苯環共軛體系的形成，并使OCP溶液褪色[24]。

圖1 OCP與γ-CD形成包絡物褪色的原理示意

2.2 γ-CD與OCP包絡物的光譜分析

由圖2可知，OCP在堿性條件下最大吸收波長為567 nm，在與γ-CD形成包絡物后，OCP-(γ-CD)譜峰形狀與OCP類似，而在最大吸收波長處則出現顯著減色效應。由圖2中還可發現，在567 nm下OCP-(γ-CD)的減色程度隨γ-CD含量的增加而增大，即在一定范圍內，此吸光度差值ΔA與γ-CD濃度呈線性關系，符合朗伯—比爾定律。這也是本文基于鄰甲酚酞褪色法的γ-CD含量分光光度測定的理論依據[25]。

圖2 OCP及不同濃度γ-CD與OCP形成包絡物的吸收光譜

2.3 顯色時間的確定

OCP-(γ-CD)體系達到穩定狀態需要一段時間，期間樣品的吸光度會隨時間的增加而減小，即發生褪色效應。以一定時間為間隔測定其吸光度，并以被測樣品溶液與空白溶液吸光度差ΔA對顯色時間作圖，結果如圖3所示。可知，在前5 min OCP-(γ-CD)形成速度較快，吸光度降低較大，褪色效應明顯。其后形成速率變得緩慢，吸光度降低程度也隨之減小。顯色15 min 后，吸光度達到穩定，并在其后10 min內基本保持不變。本文選擇γ-CD與OCP混合靜置15 min后測定其吸光度。

圖3 OCP-(γ-CD)形成速率及穩定性

2.4 測定條件對γ-CD測定的影響

2.4.1 pH對γ-CD測定的影響

加入不同pH值的碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液使體系呈不同pH, 按1.3.2小節中實驗的方法測定其吸光度, 并以ΔA對γ-CD濃度作圖，結果如圖4所示。

起初隨pH增大測定曲線斜率隨之增大，即靈敏度升高。當pH=9.51時，斜率達到最大值，超過此pH斜率又有所下降。由2.1中原理分析可知，當OCP分子處于變色范圍內時，結構不穩定，部分OCP分子在與γ-CD形成包絡后分子發生重排，共軛結構遭到破壞，使溶液出現減色效應。故本法γ-CD含量的測定需要適宜的堿性環境。但當體系堿性過高時，這種由醌式向內酯式的結構轉變可能較難發生，使褪色現象減弱[26]。由此可知，以OCP為探劑的γ-CD分光光度測定時，其緩沖體系pH應處于OCP分子的變色范圍內，但不宜過高，在本文建立的方法中以pH=9.51為宜。

圖4 pH對γ-CD測定的影響

2.4.2 溫度對γ-CD測定的影響

由圖5可知，在30 ℃以下，隨著溫度的升高，測定曲線的斜率逐漸增大，即靈敏度提高，說明γ-CD與OCP分子形成復合物的驅動力大小受溫度的一定影響。適當提高溫度可使OCP-(γ-CD)包絡物的穩定性增加，使減色效應增強，提高了檢測的靈敏度。但當溫度超過30℃后，曲線斜率又有下降趨勢，且相關系數R2值較小，說明標曲線性關系下降。可能是由于溫度過高時不利于OCP-(γ-CD)結構的穩定，不僅會影響檢測的靈敏度，也容易引起數據波動，影響檢測的準確性。故在本文中γ-CD含量的測定溫度以30 ℃為宜。

圖5 溫度對γ-CD測定的影響

2.4.3 OCP濃度對γ-CD測定的影響

加入3 mL不同濃度的OCP溶液，測定其吸光度，并以ΔA對γ-CD濃度作圖, 結果如圖6所示。可以看出，OCP 濃度對測定ΔA與γ-CD濃度之間的線性關系影響不大，但影響測定的靈敏度。標準曲線斜率隨OCP濃度的提高逐漸增大，但當OCP濃度大于0.21 mmol/L后，曲線斜率雖然繼續增加，但此時測試樣品的吸光值已大于1，超出朗伯—比爾定律的最佳測定濃度范圍，故綜合考慮測試方法的靈敏性及測試結果的可靠性，本文選擇探劑OCP濃度為0.21 mmol/L。

圖6 OCP濃度對γ-CD測定的影響

2.5 標準曲線與檢出限

在選定的測定條件下，按實驗方法測定其吸光度，并以ΔA對γ-CD濃度作圖，結果如圖7所示。當測定γ-CD 的濃度范圍為0～15 mmol/L時，R2為0.997 5；但當其濃度測定范圍擴大為0～21 mmol/L時，R2降低為0.971 2。試驗確定γ-CD的線性測定范圍為0～15 mmol/L。校準曲線方程ΔA=0.032 5cγ-CD(mmol/L)，R2為0.997 5。檢出限為0.066 mmol/L，表觀摩爾吸光系數ε=3.06×103Lmol-1cm-1。

圖7 γ-CD測定線性范圍的確定

2.6 γ-CD測定的重復性實驗與標準加入回收實驗[28]

配制25 mmol/L的γ-CD標準儲備液100 mL，從中取5 mL稀釋至一定體積，按1.3.2中的實驗方法測定γ-CD含量，平行測定10 次，作為γ-CD測定的重復性實驗，結果如表1所示。再各取5份25 mmol/L 的γ-CD標準儲備液5 mL加入不同試管，隨后繼續加入不同量的標準儲備液，并均稀釋至同等體積，測定加標樣品濃度并計算回收率，結果如表2所示。可以看出，重復性測定結果RSD=1.47%(n=10)，回收率在99.1～101.5%之間，表明本分光光度法測定γ-CD含量有較高的準確度和可重復性[29]。

表1 γ-CD測定的重復性實驗結果

表2 γ-CD測定的加標回收率實驗結果

2.7 分光光度法與HPLC法測定γ-CD的比較

配制已知濃度(4.5 mmol/L的)γ-CD標準溶液，分別采用1.3.3中的HPLC法及本文的分光光度測定法進行濃度測定，每種測定方法平行測定五次。同時, 將分光光度法測定的樣品結果與高效液相色譜法測定的結果進行對比, 結果見表3。從表3中的數據可知，兩種方法的測定結果相當吻合，分光光度法的平均測定值、標準偏差與(RSD)變異系數均與HPLC法相差很小，說明其在精準度方面已經十分接近色譜法。但由于分光光度測定法與HPLC法相比，具有操作簡便、測定快速、設備簡單，且對實驗人員技術水平要求不高等優點，因此更易于推廣普及。

表3 分光光度法與HPLC法測定γ-CD 的結果比較

3 結論

首次以鄰甲酚酞(OCP)為探劑建立了基于OCP褪色反應的γ-CD含量分光光度測定方法。當OCP濃度為0.21 mmol/L，碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液pH=9.51，30 ℃顯色15min時，減色程度ΔA與γ-CD濃度在0～15 mmol/L范圍內線性關系良好，R2=0.997 5。該測試方法靈敏度高，表觀摩爾吸光系數ε=3.06×103Lmol-1cm-1，檢出限為0.066 mmol/L。樣品平均實測回收率在99.1%～101.5%之間，測定結果RSD為1.47%(n=10)，具有良好的穩定性與可重復性。此分光光度法與HPLC法的測定結果較為吻合，準確度高，加之其測定方法簡便，測定快速、普及性強等優點，有望成為一種新的γ-CD定量分析的有效工具，應用于γ-環糊精的工業化生產和加工中。