金銀花、山銀花藥效與安全性研究

李文沛 俸婷婷 周英

摘 要：研究金銀花、山銀花提取物的體外抑菌、體內解熱和抗內毒素作用以及對用藥安全性進行探討。采用微量肉湯法測定提取物對供試菌株的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；通過建立大鼠內毒素LPS熱毒血癥模型測定大鼠下丘腦cAMP、AVP和血液中ET含量變化研究提取物解熱和抗內毒素能力；通過建立大鼠致敏模型測定血液中IgE比較用藥安全性。結果表明提取物對除白色念珠菌外的供試菌株具有較好的抑制作用，有很好的體內解熱和抗內毒素作用，安全性結果表明高劑量的灰氈毛忍冬提取物會導致大鼠過敏。證實金銀花、山銀花具有較好的抑菌活性、解熱和抗內毒素作用，高劑量用藥存在過敏風險。

關鍵詞：金銀花；抑菌作用；cAMP；ET；IgE

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）03-00 -0 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.001

Study on the pharmacodynamics and safety of Flos Lonicerae Japonicae and Flos Lonicerae

LI wen-pei1，2，3，FENG Ting-ting2，3，ZHOU Ying2，3*

（1.College of Pharmacy， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. Guizhou Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug Engineering Center， Guiyang， Guizhou 550025， China； 3. Guizhou Medicine Edible Plant Resources Research and Development Center， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：The bacteriostatic， antipyretic and antiendotoxin effect of extracts from Flos lonicerae japonicae and Flos lonicerae was studied and the safety of using them as medicine discussed. The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of the extracts against tested microbes were determined by microbroth method. The content changes of hypothalamic cAMP and AVP and ET in blood were determined by establishing a rat model of endotoxin LPS hyperthermia in order to study the antipyretic and anti-endotoxin ability of the extract. The safety of IgE in blood was determined through a rat allergic model. The results showed that the extract of Flos lonicerae japonica and Flos lonicerae has good antipyretic and anti-endotoxin effect and better inhibitory effect on the tested microbes except Candida albicans. Safety results showed that high dose of the extract could lead to anaphylaxis.

Key words： Flos Lonicerae japonica； antibacterial； cAMP；antipyretic； anti-endotoxin.

金銀花（Flos lonicerae japonica ）與山銀花（Flos lonicerae）是忍冬科忍冬屬植物干燥的花蕾或帶初開的花，其中忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）被列為金銀花唯一的藥源植物，其余收錄在山銀花中。兩者都具有清熱解毒，疏散風熱之功效，主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等癥[1]。近年來研究表明金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、增強免疫力，抗氧化，解熱抗炎、保肝、降血糖、抗腫瘤[2-5]等多種藥理作用。研究表明在致熱源可導致體溫調節中樞的調定點上移引起發熱，cAMP是調節體溫的重要的中樞制熱介質，與體溫呈正相關[6]，精氨酸加壓素（AVP）是由下丘腦合成的九肽神經肽，與體溫升高呈負反饋調節，測定下丘腦中的cAMP、AVP含量變化能在一定程度上反映藥物對體溫調節中樞的作用[7]。免疫球蛋白E（IgE）是臨床判斷超敏反應的重要指標[8]，為探討金銀花、山銀花用藥的安全性，擬建立動物制敏模型，與模型組比較評價其安全性。本實驗以忍冬、黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）[9]的水提物與70%乙醇提物為研究對象，分別觀察其體外對常見病原菌的抑制作用，進行體內解熱、抗內毒素及安全性實驗，為研制中藥制劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003；白色念珠菌CMCC（B）98001；變形桿菌CMCC（B）49027；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501；大腸桿菌CMCC（B）44289；銅綠假單胞菌CMCC（B）10104（中國醫學微生物菌種保藏中心）；糞腸球菌ATCC 29212（美國標準菌庫）。

1.2 供試藥材

黃褐毛忍冬：安農德臥（安龍縣德臥鎮大水溝村提供）

忍冬：巨花一號（安順市鎮寧縣黃果樹采摘）

灰氈毛忍冬：綏陽灰氈（綏陽縣茅婭鎮擁德村龍二組提供）。

1.3 藥物與試劑

營養瓊脂（上海博微生物技術有限責任公司 批號：170405），營養肉湯（杭州百思生物技術有限責任公司 批號：20170701001），青霉素鈉（北京哈藥責任有限公司，批號：080091248），NEST96孔板（海門市春博生物實驗器材廠，批號：071017A005），胎牛血清50 mL（浙江天航生物科技股份有限公司，批號：11011-8611），內毒素LPS（合肥博美生物有限公司，Sigma L2880），大鼠環磷酸腺苷（cAMP）、精氨酸加壓素（AVP）、內毒素（ET）、免疫球蛋白E（IgE）ELISA檢測試劑盒（安徽萊爾科技有限公司），一次性負壓采血管（山東省成武縣醫療制品廠，批號：20170402）。

1.4 實驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，型號YQX-LS-50SⅡ）、恒溫恒濕培養箱（北京科偉永興儀器有限公司，型號：HWS-150）、冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：GB 12021.2-2008）、電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：WGL-685）、超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：CJ-2D）、恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司，型號：ZWYR-2012C）。

1.5 實驗動物

清潔級SD大鼠，體重230～260 g。（購于成都動物培養所）。

1.6 體外抑菌試驗方法

1.6.1 金銀花、山銀花水提物、70%乙醇提取物的制備

水提取物的制備 稱取不同品種的干燥藥材50 g，以料液比1∶8加入蒸餾水，煮沸回流提取90 min收集濾液，同法將藥渣煮沸回流提取2次。合并濾液，減壓濃縮成浸膏后冷凍干燥，稱取冷凍干燥的提取物加蒸餾水配置成2.048 g/mL的待測藥液即為水提取物。同法制備70%乙醇提取物，動物實驗提取物料液比為1∶20。

1.6.2 實驗菌懸液的制備

配置營養肉湯培養基并分裝于150 mL三角瓶，置于滅菌鍋高溫高壓滅菌20 min冷卻待用。在無菌操作臺內用灼燒后的接種環挑取凍干菌粉末置于預先冷卻待用的無菌液體培養基內，搖晃均勻放置在37℃的100 r/min的搖床培養24 h。取1 mL菌液稀釋1×106、1×107、1×108均勻涂布在無菌瓊脂平板培養18 h進行菌落計數，計算合適稀釋倍數使菌落數約為2×106CFU/mL。

1.6.3 最低抑菌濃度（MIC）與最低殺菌濃度（MBC）的測定

根據CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度MIC，在超凈工作臺內取一次性無菌96孔板，設置實驗組A1～A9；陽性組A10；正常組A11；空白組A12。除第一列外，向A1～A9孔各加入100 μl營養肉湯，向第一列A1～A9加入200 μl待測藥液，從第一列孔吸取100 μl藥液加入第二列混勻吸取100 μl加入第三列直至第八列依次倍半稀釋，從第八列吸取100 μl棄去。再吸取100 μl配置好的菌懸液加入各孔中混勻，使A1～A9藥液濃度為1024、512、256、128、64、32、16、8、4 mg/mL，菌濃度為1×106 CFU/mL。A10孔中加入2萬單位的青霉素鈉100 μl和100 μl營養肉湯，A11孔加入100 μl營養肉湯和100 μl的菌懸液，A12孔加入200 μl的營養肉湯，使每孔均為200 μl。將96孔板放置在37℃恒溫培養箱培養18 h后取出，觀察讀取MIC，以與澄清透光組對應的最低濃度孔為MIC。從上述各孔中吸取100 μl加到預先配置好的無菌營養瓊脂平板內，各濃度設置4個平行板，用灼燒冷卻后的涂布棒均勻涂板，然后放置在恒溫培養箱內培養18 h，取出觀察，以肉眼觀察沒有菌落或者菌落數少于5個的孔對應的最低藥液濃度作為MBC。

1.7 解熱與抗內毒素試驗方法

1.7.1 LPS熱毒血癥模型建立

根據《中國藥典》2015年版金銀花、山銀花的人的臨床劑量，計算實驗大鼠臨床劑量約為1.35 g/kg（生藥量），設置低、中、高劑量藥物濃度梯度，低劑量組為5倍臨床劑量6.75 g/kg，中劑量組為10倍臨床劑量13.5 g/kg，高劑量組為20倍濃度臨床劑量27 g/kg。取168只SD大鼠分為21組，每組8只雌雄各半。第一至九組分別為三種藥材水提物高中低劑量，第十至十八組分別為三種藥材70%乙醇提物高中低劑量，十九組為LPS模型組，二十組為板藍根組給予6.75 g/kg（生藥量）板藍根沖劑，二十一組為正常組給予生理鹽水灌胃。前二十組每天灌胃給藥1次，連續給藥6天，第6天給藥之后禁食不禁水過夜，第7天給藥后1小時各組腹腔注射LPS內毒素100 μg/kg造模。

1.7.2 大鼠下丘腦cAMP、AVP含量測定

發熱高峰6 h將大鼠斷頭法處死，于冰浴下迅速取出全腦，于視交叉與灰結節之間取下丘腦組織。稱取 50 mg 新鮮下丘腦組織，加入細胞裂解液0.5 mL，室溫裂解30 min。超聲裂解1 min后4℃、13000 r/min離心15 min，取上清液采用雙抗體夾心ELISA 法測定cAMP、AVP含量，按試劑盒說明操作進行測定。

1.7.3 大鼠血清內毒素ET含量測定

發熱高峰6 h用乙醚將大鼠麻醉，采用腹腔主動脈取血法，用一次性負壓肝素鈉管取血5 mL，3000 r/min離心0.5 h，取上清。采用雙抗體夾心ELISA 法測定血液ET含量，測定方法按試劑盒說明操作。

1.8 安全性實驗方法

1.8.1 大鼠過敏模型建立

參照國家食品藥品監督管理局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》設置金銀花與山銀花水提物低、高藥物濃度梯度，低濃度為臨床劑量5倍（6.75 g/kg），高劑量為臨床劑量10倍（13.5 g/kg）。取64只SD大鼠，分為8組，每組6只雌雄各半。第一至六組分別為三種藥材提取物低、高濃度，第七組為過敏模型，第八組為正常對照組。第一至六組每天灌胃給藥一次連續給藥10天，第七組采用大鼠尾靜脈推注10 mg/mL的胎牛血清1 mL，隔日給藥方式。第八組尾靜脈推注生理鹽水1 mL。

1.8.2 大鼠免疫球蛋白IgE測定

末次給藥10 h后用乙醚將大鼠麻醉，采用腹腔主動脈取血法，用一次性負壓肝素鈉管取血5 mL以上，3000 r/min離心0.5 h，取上清。采用雙抗體夾心ELISA 法測定血液IgE含量，測定方法按試劑盒說明操作。

1.9 統計學方法

數據均以平均值±標準差（x±s）表示。采用STATVIEW 統計軟件進行ANOVA 和 t-tests分析，當P<0.05時認為結果具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 金銀花、山銀花提取物抑菌結果

供試的三種中藥材在實驗設計濃度下的體外抑菌結果見表1、表2。

結果顯示：水提物的抑菌作用要明顯優于70%乙醇提取物抑菌作用。金銀花、山銀花的抑菌作用有明顯差異，供試藥材抑菌強弱順序：巨花一號>安農德臥>綏陽灰氈。金銀花、山銀花提取物對白色念珠菌均無抑制作用，對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用。

2.2 金銀花、山銀花解熱作用結果

表3結果顯示：與模型組比較正常組（P<0.01）說明造模成功。與模型組比較各組具有顯著性差異（P<0.05）說明提取物均有抑制下丘腦cAMP升高的作用，其中綏陽灰氈低、中、高劑量組與模型組比較表現出極顯著差異（P<0.01）。

表4結果顯示：與模型組比較正常組（P<0.01）說明造模成功。與模型組比較各組標出極顯著性差異（P<0.01），從下丘腦AVP含量上看實驗各組均大于模型組，說明提取物均有促進抗利尿激素AVP升高的作用，其中70%乙醇綏陽灰氈毛忍冬高劑量組對促進抗利尿激素升高效果最好。

2.3 金銀花、山銀花抗內毒素作用結果

表5結果顯示：與模型組比較正常組（P<0.01）說明造模成功。與模型組比較各組表現出極顯著性差異（P<0.01），說明各組都有明顯的抗內毒素作用。其中巨花一號水提物與醇提物對ET清除作用相當，安農德臥和綏陽灰氈70%乙醇提取對ET的清除要效果優于水提物的清除效果，其中綏陽灰氈醇提物高劑量組對內毒素ET的清除效果最佳。

2.4 金銀花、山銀花體內過敏實驗結果

表6結果顯示：與過敏模型組比較正常組（P<0.01）說明造模成功，除綏陽灰氈高劑量組外與模型組（P<0.01）表現出極顯著差異，與正常組比較巨花一號高劑量與綏陽灰氈高劑量組（P<0.01）表現出極顯著差異，血清IgE含量比較，巨花一號高劑量組血清IgE含量小于正常組表明未引起過敏反應，綏陽灰氈高劑量組血清IgE含量明顯高于正常對照組，交叉對比說明綏陽灰氈高劑組引起機體過敏反應。

3 結論與討論

文獻中記錄金銀花和山銀花在體外抑菌活性上存在差異，經閱讀文獻比較發現體外抑菌實驗影響因素較多，其中主要影響因素為藥材產地、試驗方法、提取工藝、供試菌濃度、中藥材提取部位等[10]，本實驗中金銀花、山銀花均取自貴州本地，可為本地相關研究提供參考。本研究表明金銀花、山銀花解熱作用和抗內毒素作用存在明顯差異，其中忍冬和灰氈毛忍冬的解熱效果優于黃褐毛忍冬，灰氈毛忍冬抗內毒素作用優于忍冬，推測由于金銀花與山銀花在化學成分含量方面存在差異，灰氈毛忍冬中綠原酸類化合物含量明顯高于金銀花[11]，綠原酸有較高清除自由基作用，而金銀花較山銀花含有較多木犀草苷[12-13]，木犀草苷能顯著提高自由基，金銀花與山銀花的藥效是綠原酸、揮發油、黃酮類、三萜皂甙等多種成分共同作用的結果。過敏實驗結果顯示高劑量的灰氈毛忍冬提取物會引起小鼠超敏反應，高劑量的忍冬提取物并未引起過敏，在精細醫療中不可選擇有潛在用藥風險的山銀花，另外木犀草苷中某些成份濃度過高會對正常細胞（如人體肺胚胎纖維原細胞、人體臍帶血管內皮細胞）有毒副性作用[14]，因此用藥劑量及不同中藥材混用需要更多探討；此外中國是濫用抗生素最嚴重的國家之一，不合理的使用抗生素會對人體帶來巨大負擔同時產生更多耐藥菌種，開發中藥抗生素替代品具有巨大的應用前景[15]，本文旨為金銀花、山銀花的臨床開發與應用提供參考。

參 考 文 獻：

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中國人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 胡 璇，李衛東，等.四倍體金銀花藥材體外抗菌抗病毒實驗研究[J].中國現代重要，2015，17（11）：1160-1170.

[3] 嚴雪龍，孟愛平，濮社班.金銀花抗炎免疫活性研究進展[J].中國野生植物資源，2016，32（2）：41-44.

[4] 沈玲玲，胡志軍，王志良，等.金銀花中總黃酮的提取及其消除自由基的研究[J].時珍國醫國藥，2011，22（5）：1169-1170.

[5] Wang J，Zhao X Z，Qi Q，et al.Macranthoside B，a hederagenin saponin extracted from Lonicera macranthoides and its antitumor activities in vitro and in vivo[J].Food Chem Toxicol，2009，47（7）：1716.

[6] 白 寧，曹 宇，金蓮錦.家兔發熱誘導熱休克轉錄因子1聚合對體溫及下丘腦cAMP含量的影響[J].第二軍醫大學學報，2008，29（7）：773-777.

[7] 董 柔，封文平，曾凡星，等.熱習服對高溫力竭運動大鼠體液調節激素及下丘腦抗利尿激素合成的影響[J].中國運動醫學雜志，2012，31（11）：983-993.

[8] 陳盼碧，宣 錦，史林威，等.熱敏灸對過敏性鼻炎大鼠血清IgE、IL-4含量的影響[J].中國現代醫學雜志，2017，27（4）：17-21.

[9] 童 紅，江維克，周 濤，等.貴州金銀花與山銀花的產業現狀調查[J].貴州農業科學，2014，42（1）：238-242.

[10] 唐 亮，劉翠艷，韓春陽，等.中藥研究常用三種體外抑菌方法的比較[J].中國中醫藥科技，2011，18（5）：419-420.

[11] 周日寶，童巧珍.灰氈毛忍冬與正品金銀花的綠原酸含量比較[J].中藥材，2003，26（6）：399.

[12] 楊倩茹，趙媛媛，郝江波，等.金銀花與山銀花化學成分及其差異的研究進展[J].中國中藥雜志，2016，41（7）：1024-1211.

[13] Lin L M，Zhang X G，Zhu J J，et al.Two new triterpenoid saponins from the flowers and buds of Lonicera japonica[J]. AsianNat Prod Res，2008，10（9 /10）：925.

[14] 閆慶峰，楊達寬，黃云超，等.木犀草素對小鼠巨噬細胞免疫功能的影響[J].昆明醫學院學報，2007，28（3）：39-42.

[15] 李福長，劉梨平.我國抗生素濫用現狀及其對策[J].臨床合理用藥雜志，2014，7（9）：175-177.