超聲協同糖基化對蛋清粉致敏性及結構的影響

宋啟東 涂宗財,2 王 輝 楊文華 劉光憲 陸建偉

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022)

食物過敏是指機體攝入食物或食品添加劑而引起的消化系統內或全身性免疫反應，常見的過敏癥狀有胃腸道紊亂、蕁麻疹和哮喘等[1]。近年來，食物過敏發生率不斷增加，有近5%的成年人和8%的兒童對食物過敏[2]。因此，降低食物過敏發生率是目前亟待解決的問題。眾所周知，雞蛋是人類最主要的食物資源之一，由于其具有優良的加工特性，因此廣泛應用于加工食品中。但它也是引起食物過敏的主要過敏源，且過敏原主要存在于蛋清中[3]。因此，研究蛋清中的過敏蛋白對于降低雞蛋過敏發生率具有重要意義。目前，對雞蛋蛋白致敏性的研究主要是采用單一方法降低雞蛋中某種特定過敏蛋白，如Mine等[4]報道通過羧甲基化可以降低卵轉鐵蛋白和卵類黏蛋白的致敏性；Shin等[5]報道熱處理可以降低卵清蛋白致敏性但增加了卵類黏蛋白致敏性；Seo等[6]報道10 kGy劑量的伽馬射線輻照可以部分降低卵清蛋白致敏性。而關于采用復合改性方法降低雞蛋蛋白體系的研究還很少。

復合改性具有高效、協同等優點，既可以互補單一方法的不足，又可以更快速、全面地改性樣品。本課題組前期研究中發現高強度超聲能夠促進蛋白結構展開[7]，Ma等[8]通過外接葡萄糖的糖基化使卵清蛋白致敏性顯著降低，Guan等[9]發現超聲波對糖基化有積極的促進作用。由于食品是一個復雜的體系，有必要研究食品加工方式對復雜體系過敏蛋白(如市售蛋清粉)致敏性的影響。因此，本試驗擬采用超聲預處理結合糖基化復合改性市售蛋清粉，通過間接ELISA法，以人血清IgE結合力為指標評價蛋清粉中蛋清蛋白的致敏性，通過間接競爭ELISA法，以兔血清IgG結合力為指標評價蛋清粉中卵清蛋白的致敏性，利用紫外光譜、熒光光譜和電泳分析其結構及分子量變化，研究超聲波協同糖基化修飾對蛋清粉結構和致敏性的影響，為脫敏蛋制品的研發提供更具實際參考價值的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蛋清粉：鄭州奧冉化工有限公司；

卵清蛋白、羊抗兔酶標二抗、羊抗人酶標二抗：美國Sigma公司；

兔血清：自制；

人血清：美國PlasmaLab International公司；

其他試劑均為常用分析純。

1.1.2 主要儀器設備

電泳儀：Mini protean Tetra MP4型，美國BIO-RAD公司；

酶標儀：SynergyH1型，美國Bio Tek公司；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將蛋清粉用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)稀釋到10 mg/mL，離心后取上清液，再分別進行以下處理：

(1) 熱處理：凍干處理后在70 ℃、相對濕度75%的條件下反應6 h。

(2) 糖基化：按糖∶蛋白質量比2∶1向溶液中加入葡萄糖，冷凍干燥后于70 ℃、75%相對濕度下反應6 h。

(3) 不同強度超聲預處理結合糖基化：分別在120，360，600，840，1 080 W下超聲15 min和在600 W下超聲5，10，15，20，25 min，整個超聲過程通過冰浴將溶液溫度控制在20 ℃ 以下。然后按糖∶蛋白質量比2∶1加入葡萄糖，冷凍干燥后于70 ℃、75%相對濕度下反應6 h。

1.2.2 分子量測定 將樣品用PBS稀釋至10 mg/mL，加上樣緩沖液后煮沸10 min，再離心20 s，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠，樣品上樣量10 μL，80 V跑膠，結束后染色1 h，再用脫色液脫去底色。

1.2.3 內源性熒光測定 根據文獻[10]，將樣品用PBS稀釋成0.1 mg/mL，激發波長280 nm，在300～450 nm對發射波長進行光譜掃描。

1.2.4 表面疏水性測定 根據文獻[11]，以ANS為熒光探針，將樣品用PBS稀釋成一系列濃度梯度(0.25～2.00 mg/mL)，取2 mL樣品與10 μL ANS試劑混勻，在激發波長390 nm，發射波長400～600 nm的條件下進行測定。以樣品濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，斜率為表面疏水性(H0)。

1.2.5 自由氨基含量測定 根據文獻[12]，將樣品用PBS稀釋成40 mg/mL，分別取10 μL樣品和不同濃度(0.0～0.4 mg/mL)賴氨酸與200 μL OPA試劑混勻，避光反應2 min，于340 nm處測定其吸光值，根據賴氨酸標曲計算樣品自由氨基含量。

1.2.6 卵清蛋白致敏性測定 以兔血清IgG結合力為指標，采用間接競爭ELISA法測定樣品中的卵清蛋白致敏性。每孔加入100 μL 2 μg/mL卵清蛋白標品，4 ℃包被過夜，洗板，拍干；加250 μL 5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗板，拍干；分別加50 μL卵清蛋白標品(0.25～64.00 μg/mL)和50 μL 40 μg/mL 樣品，再加50 μL兔抗卵清蛋白血清，37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL二抗37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL顯色液37 ℃反應15 min；加100 μL H2SO4終止反應，450 nm測吸光值。以卵清蛋白標品的濃度對數為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖，通過線性函數得到樣品致敏性，進而計算其降低率。

(1)

式中：

c——卵清蛋白致敏性降低率，%；

C0——未處理原樣的致敏性，μg/mL；

C1——處理后樣品的致敏性，μg/mL。

1.2.7 蛋清蛋白致敏性測定

(1) 血清庫：1支對雞蛋不過敏的血清以及4支對雞蛋過敏的血清，4個患者(P1、P2、P3、P4)的病史見表1。

(2) 每孔加入100 μL 100 μg/mL的樣品，4 ℃包被過夜，洗板，拍干；加250 μL 5%脫脂奶粉進行37 ℃封閉1 h，洗板，拍干；加100 μL人血清37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL二抗37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL顯色液37 ℃ 反應15 min；加100 μL H2SO4終止反應，450 nm測吸光值。按式(2)計算IgE結合力。

表1 雞蛋過敏患者病史Table 1 Clinical history of egg allergy patients' sera

A=A1-A0，

(2)

式中：

A——IgE結合能力；

A0——一抗為未對雞蛋過敏的人血清所測得的吸光度；

A1——一抗為患者血清所測得吸光度。

1.2.8 數據統計與分析 Origin 9.0作圖，SPSS 17.0分析顯著性(P<0.05)，平行試驗至少3次。

2 結果與分析

2.1 分子量分析

如圖1所示，經熱處理、糖基化和復合處理后只有卵轉鐵蛋白條帶幾乎完全消失，說明卵轉鐵蛋白不穩定，易發生聚集。經糖基化和復合處理后卵清蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶的條帶變淺且發生了輕微的上移，說明這3種蛋白發生了糖基化反應，并且復合處理后上移程度更大，說明超聲預處理可以顯著促進糖基化反應，該結果和Guan等[9]的一致。同時，不同功率超聲波-糖基化處理后，其蛋白質條帶的上移程度明顯不同，呈先增加后降低的趨勢，且在600 W時上移程度最大，說明相比于超聲時間，功率對糖基化影響程度更大，并且適度的超聲功率才能更好地促進糖基化反應。這可能是超聲功率的增加影響了蛋白更深層的結構，促進更多的結構展開，使空間位阻更大程度地降低并暴露出更多的糖基化結合位點，促進糖基化反應，但過度超聲也會使蛋白結構重新折疊[13]進而阻礙糖基化反應。

U0為未處理原樣；C1為單獨熱處理；C2為單獨糖基化處理；5，10，15，20，25，120，360，600，840，1 080分別代表600 W下超聲5，10，15，20，25 min和120，360，600，840，1 080 W下超聲15 min預處理后再進行糖基化的復合處理

圖1 超聲協同糖基化對蛋清蛋白分子量的影響

Figure 1 Ultrasound synergistic glycosylation on the molecular weight of egg white protein

2.2 內源性熒光分析

蛋白的內源熒光取決于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的極性以及蛋白質間、蛋白-配體間的相互作用[14]。如圖2所示，復合處理后樣品內源熒光強度隨超聲強度(時間和功率)的增加呈先降低后升高的趨勢，在15 min、600 W時最低，且均低于單獨糖基化的樣品。這可能是超聲產生的機械、空化等效應使蛋白質結構舒展，暴露更多的發色團發生熒光猝滅。并且糖基化可以使色氨酸環位置變化、蛋白結構改變、色氨酸等殘基本身發生氧化，這些都會降低熒光強度[15]。過高強度超聲后復合處理的樣品熒光強度略微升高，可能是高功率或長時間的超聲會使蛋白部分結構重新折疊，將部分暴露的發色團重新包埋。相比于熱處理，經復合或糖基化處理后樣品的內源熒光變化程度更小，說明糖基化可以一定程度穩定蛋白結構避免熱處理對蛋白結構的過度破壞[16]。

圖2 超聲協同糖基化對蛋清蛋白內源熒光強度的影響

Figure 2 Ultrasound synergistic glycosylation on the intrinsic fluorescence intensity of egg white protein

2.3 表面疏水性分析

表面疏水性(H0)是蛋白分子表面疏水基團與極性水分子環境接觸數量的指標，可反映蛋白的結構變化。如圖3所示，復合處理后H0隨超聲強度的增加呈先升高后降低的趨勢(15 min、600 W達到最大)，且均高于未處理原樣，而單獨糖基化后樣品的H0顯著降低。這可能是糖基化可以通過外接親水性基團提高親水性并將更多的疏水基團包埋進內部，并且糖基化后樣品內源熒光圖譜發生輕微的紅移，說明糖基化通過改變蛋白結構增強其極性，使H0顯著降低。而復合處理過程中，盡管促進糖基化會降低疏水性，但超聲誘導空化作用使蛋白的球形結構變為網狀結構，大量暴露內部疏水基團，還能通過破壞蛋白的疏水性相互作用誘導變性，最終顯著增加疏水性[17-18]。在15 min、600 W時H0最大也說明該條件下蛋白結構的展開程度最大，進一步增加超聲強度會使展開的蛋白重新折疊，將部分疏水基團重新包埋進內部。

U0為未處理原樣；C1為單獨熱處理；C2為單獨糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖3 超聲協同糖基化對蛋清蛋白表面疏水性的影響

Figure 3 Ultrasound synergistic glycosylation on the surface hydrophobicity of egg white protein

2.4 自由氨基含量分析

自由氨基含量可以反映糖基化程度。如圖4所示，復合改性后樣品自由氨基含量隨超聲強度的增加呈先降低后升高的趨勢(15 min、600 W達到最大)，且均低于糖基化后的樣品。說明隨著超聲強度的增加，蛋白結構逐漸展開，可以有效促進糖基化反應的進行，在超聲強度超過15 min或600 W 時，蛋白分子重新折疊、聚集使空間位阻增加阻礙了糖基化反應進行。

2.5 卵清蛋白致敏性分析

卵清蛋白是蛋清蛋白最主要的過敏原[19]。如圖5所示，復合處理后蛋清粉中卵清蛋白致敏性降低率隨超聲強度的增加呈先升高后降低的趨勢(15 min、600 W達到最大)，且均高于單獨糖基化的樣品。這是因為復合處理過程中，超聲可以展開蛋白結構修飾構象表位、促進糖基化反應，而糖基化也能通過改變蛋白結構修飾構象表位，還能通過外接糖分子阻塞線性表位[20]，最終使過敏表位得到更全面的修飾。并且其致敏性變化與蛋清蛋白的結構變化明顯一致，說明卵清蛋白對蛋清蛋白結構影響顯著。對比實驗室的前期研究發現，相同條件下高純度卵清蛋白致敏性與雜蛋白(蛋清粉)中卵清蛋白致敏性的變化趨勢基本一致，但蛋清粉中卵清蛋白的致敏性降低效果較差，可能是雜蛋白中不同抗原間普遍存在交叉反應[21]，這會增強抗體的反應性，而且作為未處理原樣的市售蛋清粉的部分構象表位可能已經在傳統加工中得到修飾。

U0為未處理原樣；C1為單獨熱處理；C2為單獨糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖4 超聲協同糖基化對蛋清蛋白自由氨基的影響

Figure 4 Ultrasound synergistic glycosylation on the free aminos of egg white protein

C1為單獨熱處理；C2為單獨糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖5 超聲協同糖基化對蛋清蛋白中卵清蛋白致敏性的影響

Figure 5 Ultrasound synergistic glycosylation on the antigenicity of allergenicity from egg white protein

2.6 蛋清蛋白致敏性分析

不同患者的IgE結合能力不同[22]。如圖6所示，經復合改性后樣品的IgE結合能力隨超聲強度的增加呈先降低后增加的趨勢，并在15 min、600 W時最低。這是因為超聲有效促進了糖基化反應的進行，蛋白結構改變使更多的構象表位被修飾，并且通過接入糖分子也使大量線性表位被阻塞，致敏性顯著降低。而過低或過高超聲強度的IgE結合能力會高于單獨糖基化，說明超聲在展開蛋白結構促進糖基化反應的同時也暴露了更多的過敏表位，使致敏性增強，但仍低于未處理原樣。通過與卵清蛋白致敏性的對比可以發現，二者的總體趨勢是一致的，可能是卵清蛋白是蛋清蛋白最主要的過敏原，可以很好地反映蛋清蛋白的變化。但蛋清粉中不致敏的蛋白也會結合葡萄糖甚至阻礙糖與致敏蛋白接觸，降低糖基化對致敏蛋白的修飾效果，同時包含多種抗原的雜蛋白存在著更復雜的交叉反應，在某抗原表位被修飾的過程中可能產生某些可被其他抗體識別的過敏表位，并且卵清蛋白含有20個糖基化位點，是糖基化效果最顯著的蛋白[23]，所以與卵清蛋白相比，蛋清蛋白經復合處理后致敏性降低程度較低，但效果仍顯著。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖6 超聲協同糖基化修飾對蛋清蛋白致敏性的影響

Figure 6 Ultrasound synergistic glycosylation on the allergenicity of egg white protein

3 結論

復合處理會改變蛋清蛋白結構從而使蛋白的致敏性發生變化，隨著超聲強度的增加蛋清粉中蛋清蛋白致敏性顯著降低，致敏性隨超聲強度的增加呈先增加后降低的趨勢，且在15 min、600 W的條件下有最大程度降低。同時，蛋清蛋白中的卵清蛋白致敏性也與蛋清蛋白結構變化相符，在15 min、600 W時有最大程度降低且降低程度比蛋清蛋白更顯著。說明研究卵清蛋白致敏性也可以一定程度地反映蛋清蛋白的致敏性變化趨勢。也說明超聲波協同糖基化修飾是一種良好的降低蛋清粉致敏性的方法，可為脫敏蛋制品的開發提供理論指導。