動態高壓微射流協同美拉德反應對α-乳白蛋白結構和功能性質的影響

楊 萍 涂宗財,3 劉 俊 邵艷紅 謝雅雯 沙小梅 張 露

(1. 江西師范大學功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌 330022；2. 江西師范大學生命科學學院,江西 南昌 330022；3. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)屬于溶菌酶家族，結構呈球形，其單體由123個氨基酸組成，分子量約為14.2 kDa。α-LA是乳清蛋白中唯一能結合鈣離子的蛋白，且4個天冬氨酸殘基均能結合鈣離子，其獨特的氨基酸序列和三維結構賦予α-LA突出的功能特性和生物學活性，使其在食品、醫藥、化妝品等行業廣泛應用[1]。在臨床領域，α-LA 具有抗氧化、降血壓、抗癌、降血脂、抗病毒、抗菌、螯合金屬等作用[2]。

目前，許多改性方法如輻照[3]、美拉德[4]、熱處理[5]等，用于提高α-LA的功能性質。而動態高壓微射流(Dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種集高速碰撞、高頻振蕩、瞬時壓力降、強剪切、氣穴作用和超高壓作用為一體的新興高壓加工技術，被廣泛用于生物大分子的改性[6]。研究發現DHPM預處理能誘導牛血清白蛋白(BSA)的結構發生去折疊，從而促進蛋白質的美拉德反應，提高BSA的美拉德反應程度[7]。此外美拉德反應是一種蛋白質的游離氨基和還原糖的羧基之間的化學反應，能改善蛋白質的功能性質，如卵清蛋白經美拉德反應修飾后，其乳化性、起泡性得到顯著改善[8]。然而，對DHPM結合美拉德反應改性α-LA的研究較少。

本研究擬以α-LA為研究對象，采用DHPM結合美拉德反應對α-LA進行復合改性，研究改性后的結構、乳化特性和抗氧化活性，為拓寬α-LA在食品工業中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛乳α-LA：L-6010，美國Sigma-Aldrich公司；

乳糖、鄰苯二甲醛(OPA)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、十二烷基磺酸鈉、β-巰基乙醇：分析純，索萊寶試劑有限公司；

大豆油：市售；

碘化鉀、甲醇：分析純，西隴科學股份有限公司；

硼砂：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

乳糖：分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：U-3200型，日本日立公司；

熒光分光光度計：F-7000型，日本日立公司；

納米超高壓均質機：NCJJ-0.007/200型，廊坊通用機械有限公司；

圓二色譜儀：MOS 450型，法國Bio-Logic公司；

冷凍干燥機：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；

旋渦混合儀：WH-866型，上海驥輝科學分析儀器有限公司；

酶標儀：SynergyH1型，美國Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 稱取一定質量的α-LA，溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，配制成濃度為1 mg/mL的溶液。經微射流均質機處理，均質壓力分別為0，80，110，140 MPa，常溫下處理3次，收集溶液，取其中一部分溶液加入等質量的乳糖，混勻，分裝凍干，分別記為LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac、LA-140-Lac，余下溶液不加糖，分別記N-LA、LA-80、LA-110、LA-140，分裝凍干冷藏備用。將凍干后的樣品置于培養箱中，在55 ℃，相對濕度65%的條件下反應8 h，反應結束后將離心管置于冰浴中終止反應。4 ℃儲存備用。

1.2.2 SDS-PAGE 根據文獻[9]。

1.2.3 接枝度的測定 根據文獻[10]。用相同的方法，以賴氨酸代替樣品做標準曲線，以吸光度為縱坐標(y)，游離氨基含量為橫坐標(x)，繪制標準曲線方程為y=1.287x+0.007。

1.2.4 內源熒光性測定 根據文獻[11]。

1.2.5 表面疏水性測定 根據文獻[12]。

1.2.6 圓二色譜分析 根據文獻[11]。

1.2.7 乳化性測定 根據文獻[13]。

1.2.8 ABTS+·清除能力 根據文獻[14]。

1.3 數據處理

本試驗均重復3次，所得試驗數據采用SPSS17.0軟件進行顯著性分析(P<0.05)，Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE

圖1為DHPM預處理結合美拉德改性對α-LA分子量的影響。由圖1可知，α-LA的分子量在14.4 kDa左右，與N-LA相比，LA-80、LA-110和LA-140的電泳條帶均無明顯變化。α-LA與乳糖混合樣品的條帶均上移，說明α-LA與乳糖發生了共價結合，分子量增加；然而，LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac條帶之間沒有顯著差別。此外所有的樣品在31 kDa附近出現明顯條帶，這是因為α-LA 在美拉德反應過程中分子之間發生了聚合，形成了二聚體[15]。

M. Marker蛋白 1. N-LA 2. LA-80 3. LA-110 4. LA-1405. LA-0-Lac 6. LA-80-Lac 7. LA-110-Lac 8. LA-140-Lac圖1 DHPM預處理結合美拉德改性前后α-LA的 SDS-PAGE電泳圖

Figure 1 SDS-PAGE ofα-LA treated by DHPM pretreatment combined with Maillard reaction

2.2 接枝度的測定

游離氨基含量能夠用來評價美拉德反應的程度[16]，并以接枝度的形式表示。如圖2所示，LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的接枝度均大于LA-0-Lac，且隨著處理壓力的增大，樣品的接枝度顯著增加(P<0.05)。表明DHPM預處理能夠促進美拉德反應，原因是高壓作用改變了α-LA的空間構象，暴露出更多的反應位點，提高了美拉德反應程度[7]。當壓力達到110 MPa時，LA-110-Lac的接枝度達到最大，說明美拉德反應程度達到最大。但當處理壓力大于110 MPa 時，LA-140-Lac的接枝度顯著降低(P<0.05)，可能是過大的壓力作用使α-LA空間結構發生改變，且美拉德反應促進了蛋白質的聚合反應，掩蓋了部分反應基團[17]，降低其接枝度。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖2 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA接枝度的影響

Figure 2 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the degree of grafting ofα-LA

2.3 內源性熒光測定

內源性熒光是檢測蛋白質三級結構常用的方法。圖3為不同處理壓力結合美拉德反應對α-LA內源性熒光的影響。經DHPM處理后，α-LA的熒光強度先升高后降低。這是因為DHPM的高速碰撞、高頻振蕩、強剪切、氣穴作用等，破壞了α-LA的空間結構，導致隱藏在蛋白質分子內部的Trp更多地暴露在極性環境中，從而增加α-LA熒光強度。當壓力超過110 MPa，LA-140熒光強度降低，與Maresca等[18]的研究結果類似。經乳糖美拉德反應后，LA-Lac體系的熒光強度顯著降低，可能是因為α-LA與乳糖的結合對部分色氨酸起到了屏蔽作用。且隨處理壓力的增大，熒光強度先增后減，LA-110-Lac的熒光強度達最低，可能是LA-110-Lac的美拉德反應程度最大，結合的乳糖最多，對色氨酸產生了更強的屏蔽效應。

圖3 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA內源性 熒光的影響

Figure 3 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the intrinsic fluorescence intensity ofα-LA

2.4 表面疏水性測定

圖4為α-LA的表面疏水性指數，經DHPM改性后，LA-80、LA-110和LA-140的H0較N-LA顯著增大(P<0.05)。這和Ruan等[17]的研究結果一致，可能是壓力作用使α-LA構象發生變化，內部疏水性基團部分暴露，H0增大。但經140 MPa處理后，H0相較110 MPa處理有所下降，可能是蛋白質分子之間存在疏水作用，當暴露的疏水基團較多時，會通過疏水作用重新聚合[19]。處理后的α-LA與乳糖發生美拉德反應后，LA-Lac的H0較LA的顯著增加(P<0.05)，且隨著壓力的逐漸增加，H0先顯著增加后降低(P<0.05)。這可能是α-LA與乳糖發生接枝反應，α-LA 結構發生改變，暴露了蛋白質分子內部的疏水性基團[20]，掩蓋了周圍的親水性基團[21]，增加了H0。當壓力達到110 MPa，LA-110-Lac的H0達到最大值。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA表面 疏水性的影響

Figure 4 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the surface hydrophobicity ofα-LA

2.5 圓二色光譜分析

采用圓二色光譜分析α-LA二級結構中各組分的含量。由圖5可知，DHPM預處理對α-LA二級結構中各組分的含量沒有顯著影響，與Subirade等[22]的結論相似；這也可能是α-LA 結合鈣離子，使其二級結構更加穩定[23]。美拉德反應后的結果見圖6和表1，α-LA的α-螺旋含量升高、轉角和無規卷曲的含量降低，但樣品LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac二級結構各組分之間沒有明顯差別，可能是因為不同的壓力處理方式對α-LA的二級結構影響不大。此外Liu等[24]研究發現蛋白質二級結構組分變化與還原糖的分子量、蛋白質和還原糖的質量比、美拉德反應的時間長短有關。說明LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的二級結構變化不明顯可能是樣品發生美拉德反應的條件一樣。

圖5 DHPM處理對α-LA二級結構的影響Figure 5 Effect of DHPM treatment on the secondary structure of α-LA

圖6 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA二級 結構的影響

Figure 6 Effect of DHPM pretreatment combined with Maill-ard reaction on the secondary structure ofα-LA

表1 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA二級結構含量的影響?Table 1 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the secondary structure content of α-LA %

? 同列上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 乳化性測定

食品中蛋白質的乳化性一般通過乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)來評價。圖7為DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA乳化性的影響。經DHPM預處理后，α-LA的EAI和ESI呈先升后降的趨勢，當處理壓力達到110 MPa，LA-110的乳化性最大。這可能是DHPM的瞬時高壓作用，使得蛋白質空間結構發生變化，極性側鏈的水合作用增強，親水性提高；與此同時一些原先被包埋在分子內部的疏水性基團暴露出來，親油性增強，兩者達到較好的平衡，乳化性能增強[25]。但當壓力高于110 MPa時，α-LA形成分子聚集體，表面疏水性減弱，水油平衡能力減弱，乳化能力下降。經乳糖美拉德后，α-LA的乳化性顯著增大(P<0.05)，可能是α-LA與乳糖產生高分子量的糖結合物，它能與疏水性蛋白質共軛結合，并牢固地吸附在水-油界面，同時親水性的糖類物質可以高度溶解于水相介質，從而提高蛋白質的乳化性質[26]。當DHPM處理壓力達到110 MPa時，LA-110-Lac的EAI和ESI最大。這可能是110 MPa時，美拉德反應程度最大，蛋白質接枝上更多的糖類，生成更多的美拉德產物。當壓力超過110 MPa，美拉德反應程度降低，產生較少的蛋白質-糖結合物，EAI和ESI值降低。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA乳化性的影響

Figure 7 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the emulsibility properties ofα-LA

2.7 ABTS+·清除能力

ABTS+·清除能力可以反映美拉德產物的抗氧化活性。不同DHPM處理壓力結合美拉德反應對α-LA的ABTS+·清除能力影響見圖8。經DHPM預處理后，α-LA的ABTS+·清除能力沒有顯著性差異(P>0.05)，說明DHPM對α-LA的ABTS+·清除能力沒有顯著影響。而經乳糖美拉德后α-LA的ABTS+·清除能力顯著提高(P<0.05)，可能是α-LA與乳糖產生的美拉德產物和ABTS+·反應，使得α-LA體系的正離子自由基含量減少，導致蛋白質

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 DHPM預處理結合美拉德反應對α-LA 抗氧化活性的影響

Figure 8 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the antioxidative activity ofα-LA

的抗氧化能力增加[27]。隨著DHPM壓力的增加，ABTS+·清除能力先增加后降低，處理壓力為110 MPa時，LA-110-Lac的自由基清除率達到最大，這是由于DHPM促進了α-LA 與乳糖的美拉德反應，生成更多的美拉德產物。當處理壓力為140 MPa，美拉德反應程度降低，生成的美拉德產物含量減少，且文獻報道色氨酸具有自由基清除能力，而美拉德反應的加熱條件會降低色氨酸的自由基清除能力[28]，因此LA-140-Lac的自由基清除率降低。

3 結論

DHPM預處理對α-LA的一級和二級結構無顯著影響，而對其三級結構有顯著影響。經DHPM預處理后α-LA的內源性熒光強度和表面疏水性增大，且呈先升后降的趨勢，在處理壓力為110 MPa的條件下達到最大。說明DHPM能改變α-LA的三級結構，誘導蛋白質內部的疏水性基團暴露，使其乳化性增強。相對N-LA，DHPM預處理結合乳糖美拉德改性后的α-LA，其乳化性和抗氧化活性增強，且隨著處理壓力的增大，呈先升高后降低的趨勢，在處理壓力為110 MPa時，乳化性和抗氧化活性最大。DHPM的作用使α-LA結構松馳，更易與乳糖結合，促進了美拉德反應，生成更多的美拉德產物，能更加牢固地吸附在水-油界面，增強乳化性；能和ABTS+·反應，減少正離子自由基，增強抗氧化活性。DHPM預處理結合乳糖美拉德反應可以改變α-LA結構并提高其乳化性能和抗氧化活性，可以為α-LA改性提供一種新的方法。