新疆喀什長壽老人腸道益生菌的分離鑒定及生物學特性研究

阿依米熱·毛拉木 努斯熱提古麗·安外爾 布沙熱木·阿布力孜 海米代·吾拉木 烏斯滿·依米提

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

人體腸道是微生物良好的棲息環境，成人腸道中的微生物數量多達1013～1014個、共15 000～36 000種，總重量達1.5 kg[1]。腸道微生物是人體最龐大、最復雜的微生態系統，具有人體不具備的代謝功能。腸道微生物及其代謝產物不僅能提供營養、促進消化[2]，還能抑制病原體的侵襲[3]、影響免疫系統發育和大腦活動[4]。Komai等[5]研究發現，長壽老人腸道內的雙歧桿菌、乳桿菌等乳酸菌數量多于普通人群，說明腸道中的乳酸菌對人體的健康和長壽有一定的促進作用。但是腸道菌群結構失調會導致肥胖、糖尿病、冠心病等慢性疾病的發生[6-7]。益生菌和益生元是調理腸道微生物群落結構的兩大腸道活力因子。益生菌是對宿主有益的一類微生物活體，它定植于人體腸道和生殖系統，能夠產生一定的功效從而改善宿主的微生態平衡，發揮有益作用。大量研究[8-9][10]23-24發現乳酸菌在降低血清中的血脂水平方面具有顯著功能，并且副作用較低。盡管乳酸菌對人體的有益作用較為突出，由于不同人的腸道菌群之間存在差異[11]，宿主與腸道微生物菌群之間存在著相互選擇的關系，因此不同人群對同種菌株的適應性及不同來源菌株對人體腸道的適應能力不同[12]。目前中國的益生菌產品多以非人源益生菌為主，忽略了菌株的來源與作用對象一致時，菌株對宿主益生功效的針對性和特異性才會增強[13]。

本試驗擬從世界公認的長壽地區喀什長壽老人腸道中分離篩選降甘油三酯乳酸菌，通過體外試驗獲得對胃酸和膽汁鹽具有一定耐受性的人源益生菌，對人體腸道具有更高的適應性和安全性等優點，可以將其直接應用于人體或乳制品，為開發和利用人源益生菌提供菌種資源儲備和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

2016年2月從喀什地區疏勒縣庫木西力克鄉采集長壽(80歲以上)老人糞便樣品一共10份。庫木西力克鄉是長壽老人集中的鄉村，提供樣品者長期飲食結構大多以牛奶、羊肉為蛋白質的主要來源，日常食物有小麥、玉米和高粱，水果和堅果是每日必不可少的部分。樣品提供者均為長期堅持農業生產勞動的農民。對照組為普通農民的糞便一共2份，并保證采樣前2周內沒有服用過任何菌類藥物，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 The information of samples

1.1.2 試劑及培養基

甘油三酯試劑盒(TG)、膽鹽：四川邁克生物科技股份有限公司；

細菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶、Taq聚合酶：上海生工生物工程股份有限公司；

改良MRS培養基：蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，無水乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂粉20 g，碳酸鈣20 g，吐溫1 mL；

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉18 g；

甘油三酯培養基：將2 g/L的聚乙烯醇水溶液與植物油按體積比3∶1混合，用超聲波處理(控制參數每次超聲5 s，間隔時間5 s，共超聲70次)后，加入到MRS培養基中，調pH至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用；

人工胃液：5 g/L的NaCl溶液、3 g/L的胃蛋白酶溶液，用1.0 mol/L的HCl調pH至3.0，0.22 L濾器過濾除菌[10]，4 ℃冰箱冷藏，備用；

膽鹽培養基：稱取膽鹽于MRS 液體培養基中，配制濃度為成1，3，5 g/L膽鹽溶液[10]35，調pH至6.5±0.2，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.1.3 主要儀器

全自動滅菌鍋：JF-SX-500型，日本TOMY公司；

生化培養箱：DP-200型，上海精宏實驗設備有限公司：

分光光度計：NanoDrop 2000c型，賽默飛世爾科技公司；

PCR儀：S1000 Thermal Cycler型，北京伯樂元業有限責任公司；

電子天平：JD200-3型，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；

凝膠成像：bioradchemidoc XRS型，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 長壽老人與普通人細菌總數的測定及比較 分別稱取1.0 g長壽老人和普通人糞便樣品，倒入9.0 mL無菌水中，吸取稀釋液1 mL進行梯度稀釋，得到10-2～10-5個稀釋度，涂布于LB培養基，37 ℃倒置培養48 h，觀察菌株生長情況，記錄菌落總數，進行比較。在改良MRS培養基上進行分離，挑選形成鈣溶圈的菌落，2組進行乳酸菌數量比較。

1.2.2 乳酸菌的分離、純化及形態學觀察 將新疆喀什地區維吾爾族長壽(80歲以上)老人采集的糞便樣品梯度稀釋，平板涂布于改良MRS培養基上，37 ℃倒置培養48 h，根據菌落形態將不同菌落進行編號，并挑取形態不同的菌落反復劃線于LB培養基分離獲得純菌落。對分離獲得的41株菌株進行革蘭氏染色試驗、過氧化氫酶接觸試驗。將革蘭氏染色結果為陽性且過氧化氫酶為陰性的菌株初步判斷為乳酸菌[14]。

1.2.3 乳酸菌體外甘油三酯降解率、耐酸耐膽鹽能力的測定

將乳酸菌按3%的接種量接種至甘油三酯培養基中，37 ℃ 培養24 h，10 000×g離心2 min，取上清液用于甘油三酯降解率的測定，以沒有接菌的甘油三酯培養液作為空白對照，利用甘油三酯試劑盒測定甘油三酯的含量[15]。甘油三酯含量和甘油三酯降解率分別按式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：

C1——樣品的甘油三酯含量，mg/mL；

A1——接種乳酸菌的含甘油三酯的MRS液體培養基中測得的甘油三酯OD值；

A2——標準液的OD值；

C——標準液的含量，mg/mL；

R——甘油三酯降解率，%；

C2——總甘油三酯含量，mg/mL。

將1.0 mL乳酸菌菌液接種至9.0 mL pH為3.0的人工胃液中，37 ℃厭氧培養，依次在0，3 h時進行取樣，測定活菌數，存活率按式(3)計算：

(3)

式中：

在實驗中，我們將事先錄好的鐵路監控視頻，作為輸入圖像導入到關鍵幀提取器，通過SIFT特征提取和卷積神經網絡的深度特征提取，自動調整網絡參數和權重，實現基于深度學習的目標檢測提取視頻圖像關鍵幀，提取出視頻的關鍵幀圖像如圖4所示。

S——存活率，%；

N1——3 h的活菌數，CFU/mL；

N2——0 h的活菌數，CFU/mL。

將乳酸菌按3%的接種量分別接種至含1，3，5 g/L的膽鹽培養基中，37 ℃厭氧培養，依次在0，3 h時進行取樣，測定活菌數，按式(3)計算存活率。

1.2.4 16S rDNA序列鑒定 參照DNA提取試劑盒方法，提取乳酸菌基因組DNA，對乳酸菌的16S rDNA進行PCR擴增，將擴增產物交由上海生工進行序列測定，得到的序列通過BLAST程序比對，鑒定菌屬信息。

將提取所得的DNA模板進行PCR擴增，采用正向引物27f:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1492R:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。PCR反應體系(50 mL)：各引物1 mL；mix 24 mL；模板1 mL；超純水補足至50 mL。PCR反應條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環，最后72 ℃延伸5 min。取擴增產物6 mL，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳液為0.5%×TBE。

1.3 數據統計與處理

利用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行分析。每組試驗至少重復3次，結果用均值±標準差表示。Prism 5作圖，采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 細菌總數的測定

表2為新疆喀什長壽老人和普通人腸道中可培養細菌和乳酸菌總數的比較。由表2可以看出，長壽老人腸道中的細菌總數比普通人的少，但長壽老人腸道中乳酸菌占的比例顯著高于普通人的。麥熱姆妮薩·艾麥爾等[16]研究發現，

表2 樣品的細菌總數Table 2 Total bacterial count

和田長壽老人的腸道益生菌在數量和種類上均與普通人群有差異，且長壽老人腸道內的益生乳酸菌的數量比普通人群腸道內的多，主要是腸球菌和植物乳桿菌占優勢。研究[5,17-18]顯示中國巴馬地區和俄羅斯高加索長壽地區人群腸道中的益生乳酸菌數量明顯高于普通人。表明人的健康與長壽均與腸道中的益生乳酸菌相關，與本研究結果一致。

2.2 乳酸菌的分離、純化及初步鑒定

利用改良MRS培養基從長壽老人組分離得到41株乳酸菌，各菌落皆為乳白色，表面光滑、整齊，形成鈣溶圈，直徑為1～3 mm；皆為革蘭氏陽性，形狀為桿狀、短桿狀或球狀，均為過氧化氫酶陰性。

2.3 乳酸菌的體外降甘油三酯能力的測定

由表3可知，不同來源的乳酸菌的甘油三酯降解率差異較大，41株乳酸菌中，A1-2和A1-10的甘油三酯降解能力最強，降解率分別為39.38%，32.33%。其次有12株菌的降解率在15%～30%，18株菌在5%～15%，9株菌在5%以下。

表3 乳酸菌降解甘油三酯的能力Table 3 Abilities of lowering riglycerids by lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測定

將14株甘油三酯降解率>15%的乳酸菌接入pH為3.0 的人工胃液中，37 ℃厭氧培養，分別在0，3 h時進行取樣，測定活菌數并計算存活率。由圖1(a)可以看出，乳酸菌在pH為3.0的人工胃液中存活率均超過12.00%，其中A2-1、A1-2、A3-1、A4-6及A4-1的存活率>50%，分別為63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%。乳酸菌能夠在酸性條件下存活，可能是因為其細胞質中的pH值始終保持在一個適宜的水平，而F1F0-ATP酶在維持乳酸菌細胞內的pH 起到至關重要的作用[19]，人體腸道中的低pH 環境也增加了F1F0-ATP酶的活性[20]，因此，試驗中不同乳酸菌耐酸能力有較大的差異，可能與菌體的來源，即個體腸道內環境的差異有一定的關系[21]。

不同字母表示具有差異性(P<0.01)圖1 乳酸菌在初始pH為3.0及1，3，5 g/L膽鹽溶液中的存活率Figure 1 The survival rate of lactic acid bacteria in the initial pH of 3.0 and 1, 3, 5 g/L bile salt solution (n=3)

由圖1(b)～(d)可以看出，在1，3，5 g/L 膽鹽溶液中的存活率>10.00%的菌株共6株，為A1-2、A2-2、A3-1、A2-1、A1-8及A4-6，這6株菌的耐膽鹽能力顯著大于其他菌株(P<0.01)。同一菌株隨著膽鹽濃度的升高，存活率反而降低。

2.5 菌株16S rDNA測序鑒定

對耐酸耐膽鹽能力較強的5株乳酸菌基因組DNA進行PCR擴增，電泳檢測擴增產物，送去上海生工測序。應用BLAST對得到的序列進行比對，從GenBank中選取相關種屬菌株16S rDNA序列，應用Cluxtal X雙重比對，用MEGA 5.0軟件進行相似性分析(表4)及系統發育樹分析(圖2)。結果表明，A1-2與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1，A3-1，A4-6與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1與干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)的同源性達到99%。

圖2 5株分離菌根據相關16S rDNA序列建立的遺傳進化樹Figure 2 The genetic evolutionary tree of 5 isolated bacteria strain in accordance with the 16S rDNA sequences表4 16S rDNA序列比對鑒定結果Table 4 The identification result by alignment of 16S rDNA sequences

菌株親緣關系最近的菌株同源性/%A1-2Lactobacillus plantarum99A2-1Enterococcus faecium99A3-1Enterococcus faecium99A4-6Enterococcus faecium99A4-1Lactobacillus paracasei99

3 結論

本研究從喀什長壽老人糞便中分離獲得41珠乳酸菌，對其進行了降甘油三酯能力試驗，篩選出14珠甘油三酯降解率>15%的菌株，進行胃酸，膽汁鹽耐受試驗。研究[22]表明，人的胃液pH值為3.0左右，空腹或食用酸性食品時的pH為1.50，小腸的膽汁鹽含量為0.03%～0.30%。對酸和膽鹽耐受性較低的乳酸菌在此環境下無法存活，因此從長壽老人樣品中分離獲得的乳酸菌具有較強的耐酸耐膽鹽能力。其中A2-1，A1-2，A3-1，A4-6，A4-1在pH為3.0的人工胃液中有一定的耐受性，在人工胃液培養3 h的存活率分別為63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%，并在膽鹽濃度分別為1，3，5 g/L的MRS培養基中存活率較高，其中A1-2的耐膽鹽能力最強，在膽鹽濃度為1，3，5 g/L的MRS培養基中的存活率分別為46.03%，41.81%，15.77%。經分子鑒定可知，A1-2為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1、A3-1、A4-6為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1為干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

通過研究發現菌株A1-2具有較強的耐酸耐膽鹽能力，且該菌株為人源性，有較高的安全性，為以后的人源益生菌的開發提供新的菌種資源。