HPLC法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰配食品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯

李 濤 周艷華 孫桂芳 楊 滔 尹偉成 楊慶懿

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；2. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品(以下簡(jiǎn)稱特醫(yī)嬰配食品)是指針對(duì)患有特殊紊亂、疾病或醫(yī)療狀況等特殊醫(yī)學(xué)狀況的營(yíng)養(yǎng)需求而設(shè)計(jì)的粉狀或液態(tài)配方食品。針對(duì)不同的嬰兒患病類型分為6種配方，包括無(wú)乳糖或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解或氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑配方、氨基酸代謝障礙配方[1]。維生素A是一類脂溶性維生素，又稱視黃醇，其主要生理功能是維持正常視覺(jué)、增強(qiáng)機(jī)體抗感染力及維持骨骼健康[2]。維生素A在特醫(yī)嬰配食品中為必須營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化成分，通過(guò)添加視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化[3-4]。

目前，維生素A測(cè)定主要有液相法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]。現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中維生素A測(cè)定是將視黃醇酯類皂化為醇類進(jìn)行分析，一般需對(duì)樣品進(jìn)行酶解、皂化、提取、分離、濃縮等步驟，操作極其繁瑣耗時(shí)[7-8]。特醫(yī)嬰配食品有6種配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)按照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中皂化條件進(jìn)行皂化，會(huì)出現(xiàn)皂化不完全、嚴(yán)重乳化、維生素A不能完全游離等現(xiàn)象，且脂溶性維生素不穩(wěn)定，在此分析過(guò)程中易損耗，回收率不高，不能進(jìn)行批量操作。本試驗(yàn)擬采用正相高效液相色譜法直接測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯[9]，以期能準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)品中營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化視黃醇的類別及含量，為檢測(cè)特醫(yī)嬰配食品中維生素A提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

特醫(yī)無(wú)乳糖配方奶粉(A)、特醫(yī)乳蛋白部分水解配方奶粉(B)、特醫(yī)乳蛋白深度水解配方奶粉(C1)/氨基酸配方奶粉(C2)、特醫(yī)早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方乳(D)，特醫(yī)母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑(E)、特醫(yī)氨基酸代謝障礙配方乳(F)：市售；

視黃醇棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.1%，德國(guó)Dr. Eherenstorfer公司；

視黃醇醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.5%，德國(guó)Dr. Eherenstorfer公司；

叔丁基甲醚、正己烷、異辛烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；

氫醌、無(wú)水乙酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

木瓜蛋白酶：酶活> 400 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-20A型，帶DAD檢測(cè)器，日本島津公司；

漩渦振蕩器：HMS-350型，上海珂淮儀器有限公司；

電子分析天平：BS224S型，德國(guó)賽多利斯公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：X1R型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

pH酸度計(jì)：PB-10型，德國(guó)賽多利斯公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-28型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取視黃醇棕櫚酸酯約25 mg(精確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，異辛烷溶解并定容至刻度；稱取視黃醇醋酸酯約25 mg(精確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度。分別精取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得10.0 μg/mL混標(biāo)儲(chǔ)備液，分別精取0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0 mL 混標(biāo)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得濃度為0.05～10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

(1) 樣品稱量：固體樣品精確稱重25 g至250 mL碘量瓶中，加入200 mL純水(約40～45 ℃)，溶解并冷卻，稱重。轉(zhuǎn)移5.0 g溶解后的新樣品至50 mL離心管，計(jì)算樣品質(zhì)量(粉末當(dāng)量)；液態(tài)樣品精確稱取5.0 g至50 mL離心管中。

(2) 酶解：800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取100 mg氫醌和4.0 g無(wú)水乙酸鈉于100 mL容量瓶中，加純水80 mL溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.2 g木瓜蛋白酶超聲5 min，冷卻后定容至刻度。向樣品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混勻后置于(37±2) ℃水浴30 min后冷卻。

(3) 提取：向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振蕩15 min，加入10.0 mL異辛烷振蕩提取15 min，5 000 r/min離心10 min，取異辛烷層用于高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：正己烷-25%叔丁基甲醚正己烷(體積比95∶5)，等梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：325 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取標(biāo)準(zhǔn)使用液注入液相色譜儀測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。視黃醇棕櫚酸酯線性方程為：Y=286 042X-662.074 5(R2=0.999 9)，視黃醇醋酸酯線性方程為Y=309 862.3X-4 460.171(R2=0.999 9)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為0.05～10.00 μg/mL，校準(zhǔn)曲線線性良好，線性低點(diǎn)是GB 5009.82—2016 中低點(diǎn)的1/4倍，測(cè)定范圍更廣。

2.2 檢出限和定量限

取空白響應(yīng)值的2～3倍對(duì)應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 μg/mL，平行測(cè)定11次，根據(jù)檢出限的計(jì)算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd為標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為工作曲線斜率)，當(dāng)取樣量為0.5 g，異辛烷體積為10.0 mL時(shí)，方法檢出限和定量限見(jiàn)表1。此方法的檢出限與定量限是GB 5009.82—2016 的1/3，說(shuō)明此檢驗(yàn)方法具有更高的靈敏度。

2.3 樣品含量測(cè)定和精密度試驗(yàn)

特醫(yī)嬰配食品A～F分別平行取樣6組，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)液相色譜測(cè)定，特醫(yī)嬰配食品A～F號(hào)中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯含量及精密度結(jié)果見(jiàn)表2、3。結(jié)果顯示特醫(yī)嬰配食品中通常添加一種視黃醇酯類作為維生素A來(lái)源，且添加量依據(jù)適用對(duì)象的差異而不同，各配方中視黃醇棕櫚酸酯含量為0.0～817.0 μg/100 g，精密度為0.9%～9.4%；視黃醇醋酸酯含量為0.0～8 683.0 μg/100 g，視黃醇醋酸酯精密度為3.3%～6.3%，精密度均滿足測(cè)定要求。

表1 檢出限和定量限Table 1 Detection limit and limit of quantification

表2 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇棕櫚酸酯含量及精密度Table 2 Content and precision of retinol palmitate in formulas for special medical purposes intended for infants

表3 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇醋酸酯含量及精密度Table 3 Content and precision of retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選取深度水解配方奶粉(C1)為代表進(jìn)行特醫(yī)嬰配食品回收率試驗(yàn)，共9份，每個(gè)濃度3份，分別添加約0.5，1.0，2.0倍樣品檢測(cè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，低中高3個(gè)加標(biāo)濃度添加量分別為3.0，6.0，10.0 μg。按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)液相色譜儀測(cè)定。視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯加標(biāo)回收率見(jiàn)表4。由表4可知，視黃醇棕櫚酸酯的不同添加濃度下回收率為82.6%～90.0%，RSD值為1.8%～2.5%，視黃醇醋酸酯不同添加濃度下回收率為81.0%～88.6%，RSD值為2.2%～4.5%，深度水解配方奶粉為特醫(yī)嬰配奶粉中最復(fù)雜基質(zhì)之一，說(shuō)明該方法對(duì)特醫(yī)嬰配食品中不同濃度視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確度。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Results of recovery for spiked samples

2.5 檢驗(yàn)方法的選擇性

視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見(jiàn)圖1，7種特醫(yī)嬰配食品中視黃醇酯圖譜見(jiàn)圖2，檢驗(yàn)方法系統(tǒng)性評(píng)價(jià)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表5。由圖1可知，視黃醇棕櫚酸酯保留時(shí)間為3.5 min，視黃醇醋酸酯保留時(shí)間為6.0 min，樣品測(cè)定過(guò)程中2種視黃醇酯均未發(fā)生明顯漂移，該檢驗(yàn)方法能準(zhǔn)確定性。由表5可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品中2種視黃醇酯的分離度均>1.8，高于R≥1.5的一般要求，理論塔板數(shù)均大于8 000，高于t≥3 000的一般要求，表明該檢驗(yàn)方法將待測(cè)成分與其它雜質(zhì)進(jìn)行了基線分離，分離效能良好，說(shuō)明該檢驗(yàn)方法具有良好的系統(tǒng)適用性。特醫(yī)嬰配食品成分極其復(fù)雜，但樣品基質(zhì)不會(huì)干擾視黃醇酯分離，表明該檢驗(yàn)方法對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒食品中2種視黃醇酯具有良好選擇性，分離度高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯Figure 1 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in standard solution

圖2 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯

Figure 2 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

表5 檢驗(yàn)方法系統(tǒng)性評(píng)價(jià)參數(shù)結(jié)果Table 5 Results of method systematic evaluation parameter

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了正相高效液相色譜測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的方法。采用木瓜蛋白酶酶解擁有脂肪膠束涂層的親水性蛋白，釋放視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯，酸化甲醇沉淀蛋白質(zhì)，異辛烷提取，氨基柱正相分離，紫外檢測(cè)2種視黃醇酯。在0.05～10.0 μg/mL時(shí)呈線性相關(guān)(R2=0.999 9)，視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯檢出限分別為2.0，2.5 μg/100 g，不同添加濃度回收率為81.0%～90.0%，也可通過(guò)公式(維生素A=視黃醇棕櫚酸酯×0.55+視黃醇醋酸酯×0.87)換算得到特醫(yī)嬰配食品中維生素A含量，此試驗(yàn)的線性范圍和檢出限均優(yōu)于現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82—2016。

前期試驗(yàn)研究表明現(xiàn)有國(guó)標(biāo)測(cè)定特醫(yī)嬰配食品中視黃醇時(shí)，多種配方產(chǎn)品皂化時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重、皂化不完全和精密差等問(wèn)題。本試驗(yàn)方法無(wú)需將視黃醇酯皂化為視黃醇，采用直接測(cè)定樣品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯，避開(kāi)操作繁雜的皂化過(guò)程，流程簡(jiǎn)單，精密度和準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)。此試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，針對(duì)特醫(yī)嬰配產(chǎn)品中的視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯檢測(cè)重復(fù)性好。此試驗(yàn)前處理酶解液還可用于測(cè)定α生育酚醋酸酯和α生育酚，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)一步研究。