抗氧化紫球藻胞外多糖酶解物制備工藝優化

董 樂 何靜艷 鄭婷婷 戴聰杰 黃衛紅 李元躍

(1. 泉州師范學院海洋與食品學院，福建 泉州 362000；2. 泉州師范學院福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發重點實驗室，福建 泉州 362000；3. 泉州師范學院近海資源生物技術福建省高校重點實驗室,福建 泉州 362000；4. 集美大學福建省海洋漁業資源與生態環境重點實驗室，福建 集美 361000)

本課題組前期從非洲大蝸牛消化道中分離出一種混合酶，酶自身無抗氧化能力，但EPS經其酶解后產物的抗氧化能力顯著提高。本研究擬以該混合酶為酶制劑，以羥自由基(·OH)清除率為綜合評價指標，對EPS的酶解工藝進行優化，并評價EPS粗品酶解前后的抗氧化活性，以期為EPS在功能性食品和藥品方面的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

紫球藻藻種：中國科學院海洋研究所藻種庫；

非洲大蝸牛消化道中制備的混合酶：1 874.52 U/g，泉州師范學院福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發重點實驗室。

1.1.2 主要儀器設備

臺式高速離心機：Allegra 64R型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-6D型，金壇市城東宏業實驗儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-1200型，上海美譜達儀器有限公司；

冷凍干燥機：FDU-2110型，上海紀革森實業有限公司；

旋轉蒸發儀：W2-100S型，上海申生科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 EPS粗品的提取 取紫球藻的KOCH培養液，4 000 r/min 離心20 min，留上清液，旋轉蒸發濃縮(45 ℃)，加入3倍體積無水乙醇醇析過夜，4 000 r/min離心10 min，收集醇析物，真空冷凍干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS粗品。

1.2.2 酶解液的制備工藝 取一定量EPS粗品配成水溶液，依次調節酶解溫度、酶解時間、酶解pH值、酶添加量(酶/底物)、保溫酶解(不斷調節pH 值，使酶解過程在初始pH 值下進行)一定時間后，沸水浴滅酶活10 min，10 000 r/min 離心10 min，得酶解液。

1.2.3 單因素試驗 通過預試驗確定酶解EPS粗品單因素試驗的基本條件為：酶解溫度65 ℃、酶解時間6 h、酶解pH值7.0以及酶添加量(酶/底物，E/S)2.8 U/mg。通過固定其他條件只改變其中一個條件來分析各單因素對酶解產物清除·OH能力的影響[14]。

(1) 酶解溫度：酶解溫度分別選取25，35，40，45，55，60，65，70，75 ℃，在酶解時間6 h，酶解pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg 的條件下，測定EPS粗品酶解產物對·OH的清除率。

(2) 酶解時間：在酶解溫度65 ℃，pH值7.0，酶添加量2.8 U/mg的條件下，分別酶解2，3，4，5，6，7 h，測定EPS粗品酶解產物對·OH的清除率。

(3) 酶解pH值：酶解pH分別選用4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在酶解溫度65 ℃，酶解時間6 h，酶添加量2.8 U/mg的條件下，測定EPS粗品酶解產物對·OH的清除率。

(4) 酶添加量：酶添加量分別選用0.1，0.7，1.4，2.0，2.8 U/mg，在酶解溫度65 ℃，酶解時間6 h，pH值8.0的條件下，測定EPS粗品酶解產物對·OH的清除率。

1.2.4 Box-Behnken響應面優化試驗 根據單因素試驗結果，采用統計軟件Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken Design試驗設計原理[15-16]，以·OH清除率為響應值，確定中心點試驗是自變量取值為試驗設計水平中值，非中心點試驗為其他取值，重復5次中心點試驗，以估計試驗誤差。

1.2.5 EPS粗品酶解產物的制備 以響應面最佳優化參數酶解EPS粗品得酶解液，10 000 r/min離心5 min，Sevage法除蛋白[17-18]后，4 000 r/min離心10 min，上清液旋轉蒸發濃縮(45 ℃)，加入3倍體積無水乙醇醇析過夜，4 000 r/min離心10 min，收集醇析物，真空冷凍干燥(-80 ℃，-5 Pa，48 h)，得EPS酶解產物。

1.2.6 EPS粗品酶解前后抗氧化活性的測定

(1) ·OH清除能力：參考文獻[14]。

(2) DPPH·清除能力：參考文獻[19]。

(3) ABTS+·清除能力：參考文獻[20]。

1.3 數據處理

所有試驗至少重復3次，用Microsoft Excel進行數據整理，所得數據以均值±標準差表示。不同平均值之間的差異顯著性檢驗采用SPSS 11.5統計軟件中的鄧肯氏多重比較法進行。顯著差異水平P<0.05，極顯著差異水平P<0.01。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度 由圖1可知， EPS粗品酶解產物對·OH的清除率隨酶解溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。當酶解溫度升至65 ℃時，EPS粗品酶解產物對·OH的清除率達到最大值。酶解過程中，酶催化反應的速度和酶的穩定性會受到溫度的影響。隨著溫度的升高，反應速度會加快，但溫度過高會導致酶失活以及變性，從而影響反應速度。因此，最佳酶解溫度選取65 ℃。

圖1 酶解溫度對EPS粗品酶解產物·OH清除 能力的影響

Figure 1 Effect of enzymolysis temperature on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.2 酶解時間 由圖2可知， EPS粗品酶解產物對·OH的清除率隨酶解時間的延長先增大后減小，在6 h時達到最大值。酶解時間大于6 h后，由于大部分EPS粗品已被酶解，且酶活力逐漸下降，酶解產物不再隨時間的延長而增加，酶解產物對·OH的清除率開始下降。因此，酶解時間選取6 h為宜。

圖2 酶解時間對EPS粗品酶解產物·OH清除 能力的影響

Figure 2 Effect of enzymolysis time on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.3 酶解pH 由圖3可知，酶解體系中pH對酶解效果有顯著的影響。當酶解pH在4.0～8.0時，隨pH的升高EPS粗品酶解產物對·OH的清除率急劇增大，pH 8.0時達到最大值，隨后快速下降。這是因為不同的酶對應不同的最適pH，過酸過堿都會使酶失活。所以酶解pH選擇8.0。

圖3 酶解pH對EPS粗品酶解產物·OH清除 能力的影響

Figure 3 Effect of enzymolysis pH on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

2.1.4 酶添加量 由圖4可知，EPS粗品酶解產物對·OH的清除率隨酶添加量的增加逐漸增加，可能是酶量的增加而可提高其水解能力，從而使酶解產物中對·OH清除活性強的組分增加。但考慮到試驗條件的可控制性和重現性，酶添加量選擇2.8 U/mg為佳。

2.2 Box-Behnken響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法對EPS粗品酶解工藝條件進行優化，因素水平見表1。

利用軟件Design-Expert 8.0.6對試驗結果(表2)進行多元回歸擬合，得數學回歸模型：

圖4 酶添加量對EPS粗品酶解產物·OH清除 能力的影響

Figure 4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on hydroxyl radical scavenging activity of the enzymatic hydrolysates

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平編碼Table 1 Factors, levels and codingTable of Box-Behnken design test

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D+0.78AB-2.92AC+1.73AD-3.48BC+1.02BD+0.36CD-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(1)

對結果進行統計分析，結果見表 3。

由表3可知，該模型P值<0.000 1，表明模型是極顯著的，而且失擬項P值為0.154 2，表明失擬項不顯著，該模型穩定。由表3中回歸系數的顯著性檢驗可知，A、B和D對EPS粗品酶解產物的·OH清除率影響極顯著(P<0.01)，C對EPS粗品酶解產物的·OH清除率影響顯著(P<0.05)；AC和BC對EPS粗品酶解產物的·OH清除率影響均顯著(P<0.05)，A2對EPS粗品酶解產物的·OH清除率影響顯著(P<0.05)，B2、C2和D2對EPS粗品酶解產物的·OH清除率影響極顯著(P<0.01)。

將不顯著項從回歸方程中剔除，進行二次方差分析，結果見表 4。結果表明，回歸方程中各項均達顯著水平，失擬項不顯著(P>0.05)?；貧w方程為：

Y=62.27+2.18A+3.25B+1.51C+9.31D-2.92AC-3.48BC-2.15A2-7.31B2-6.31C2-4.76D2。

(2)

響應面中的等高圖能夠直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，酶解溫度和酶解pH、酶解時間和酶解pH之間交互作用的等高線圖和響應面見圖5、6。

酶解溫度和酶解pH對EPS粗品酶解產物的·OH清除率的影響近似橢圓形，說明有交互作用[圖5(b)]。由圖5(a)可知，當酶解溫度一定時，EPS粗品酶解產物對·OH清除率隨pH的增加呈先增加后減小的趨勢，在pH為7.0～7.8 時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率較高，在pH一定時，EPS粗品酶解產物對·OH清除率隨酶解溫度的變化較小，當酶解溫度為65 ℃左右時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率較高。

酶解時間和酶解pH對EPS粗品酶解產物的·OH清除率的影響近似橢圓形，說明有交互作用[圖6(b)]。由圖6(a)可知，當酶解pH一定時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率隨時間的延長呈先增加后減小的趨勢，在酶解時間達6 h時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率較高，在酶解時間一定時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率隨pH的增加有較小幅度的變動，在酶解pH 7.0～7.8時，EPS粗品酶解產物的·OH清除率高。

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

表3 回歸方程顯著性檢驗和方差分析?Table 3 Analysis of variance and significance test of regression equation

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極其顯著，P<0.01；R2=0.959 3，Adj.R2=0.918 6。

表4 二次方差分析?Table 4 Quadratic analysis of variance

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極其顯著，P<0.01；R2=0.949 7，Adj.R2=0.921 8。

圖5 酶解溫度和酶解pH對·OH清除率影響的響應曲面和等高線圖Figure 5 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis temperature and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

圖6 酶解時間和酶解pH對·OH清除率影響的響應曲面和等高線圖Figure 6 Response surface plot and contour plot for effects of enzymolysis time and pHand their mutual interaction on hydroxyl radical scavenging

2.3 驗證實驗

根據Design-Expert 8.0.6軟件計算出的最優工藝條件：酶解溫度63 ℃、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，酶解時間6.3 h。按該條件進行3次平行實驗，實際測定EPS粗品酶解產物對·OH的清除率為(70.64±0.38)%，理論預測值為67.78%，兩者非常接近，表明模型預測值與實際值的誤差在允許范圍之內。說明采用響應面法優化得到的EPS粗品酶解工藝條件參數是可信的。

2.4 EPS粗品酶解前后的抗氧化活性

3 結論

本研究以從非洲大蝸牛消化道中分離的混合酶為酶制劑，通過響應面法建立EPS粗品酶解制備抗氧化酶解物工藝的二次多項回歸方程，通過方差分析，模型顯著，所得方程擬合度高。試驗結果表明，最優酶解工藝條件為：酶解溫度63 ℃、酶解時間6.3 h、酶解pH 8.0、酶添加量2.7 U/mg，在此條件下EPS酶解產物的·OH清除率為(70.64±0.38)%。

表5 EPS粗品酶解產物對自由基的清除效果Table 5 Effects of the enzymolysis EPS on radical scavenging