扛板歸不同溶劑提取物抗氧化活性研究

侯金珍，裴世成，王云，盧慧英，韋水連，李冬明，韋啟球（通訊作者）

（1.柳州市人民醫院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學醫學院，廣西 柳州 545005）

0 引言

扛板歸為一年生雙子葉草本植物，全國各地均分布，屬于蓼科蓼屬植物扛板歸（Polygonum perfoliatum L.）的地上部分。又稱蛇見退、蛇牙草、河白草等。其具有多種藥理功效，如活血化瘀、利濕消腫、清熱解毒等等。實驗研究結果表明，扛板歸具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗誘變、降血壓、抗腫瘤和止血等生物活性[1-2]。近年來國內外主要是對扛板歸的黃酮類、蒽醌類、苯丙素等成分進行較多的研究報[3-4]。但對扛板歸石油醚提取部位和扛板歸水提液不同極性部位的研究國內外報道都比較少。

本實驗以扛板歸為原料，依次分別用石油醚和水回流提取扛板歸，得扛板歸石油醚提取部位和水提取物；水提取物分別用乙醇沉淀和不同極性的有機溶劑萃取等方法，得水提取物不同極性部位。考察扛板歸不同極性部位對自由基的清除作用，評價它們的抗氧化能力，為中藥扛板歸在臨床上的應用提供實驗理論依據和進一步研究開發扛板歸奠定實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

FD-IA50真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司），SF-200高速萬能粉碎機（泰州市天泰制藥機械廠），UV-2600紫外可見分光光度計（株式會社島津制作所），XW-80A旋渦混合器（上海精科實業有限公司），DHG-9241A電熱恒溫干燥箱（上海圣科儀器設備有限公司），TDL-5-A臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），HH-1水浴鍋（常州蒙特儀器制造有限公司），FA2204B分析天平（上海精科儀器有限公司），SHZ-D(Ⅲ)循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，德國），二甲基亞砜（DMSO，AR，成都市科龍化工試劑廠），抗壞血酸（Vc ，AR，天津市福晨化學試劑廠），1，10-菲啰啉（1 H2O，AR，天津市天新精細化工開發中心），硫酸亞鐵（7H2O，AR，成都市科龍化工試劑廠），其他試劑均為市售分析純。

藥材采自廣西壯族自治區柳州市郊區（2016年7月28日），經廣西科技大學醫學院韋運東副教授鑒定為蓼科蓼屬植物扛板歸（Polygonum perfoliatum L.）的干燥地上部分。

1.2 樣品的制備

取扛板歸原藥材，干燥，粉碎（40目），取100 g，加30倍體積量（30 mL/g）的石油醚回流提取2 h。重復提取一次。減壓抽濾，合并兩次提取濾液，旋轉蒸發儀減壓回收石油醚，收集石油醚提取浸膏，經冷凍干燥，得扛板歸石油醚提取部位（A）；同時收集藥渣，揮干石油醚，待用。

取石油醚回流提取過的扛板歸粉末50 g，30倍體積量（30 mL/g）的蒸餾水回流提取 1.5 h。重復提取一次。在4000 r/min的條件下，離心機離心10 min，收集離心后的上清液，合并兩次提取的上清液，旋轉蒸發儀濃縮至一定體積。在攪拌的作用下，緩慢向濃縮液中加入4倍濃縮液體積量的無水乙醇，4 ℃條件下放置12 h ，4000 r/min條件下，離心機離心10 min，收集沉淀物，冷凍干燥，即得扛板歸醇沉物部位（B）；乙醇液相經旋轉蒸發儀回收乙醇至無醇味后，分散在一定體積純化水中，依次用等體積的、不同極性的有機溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（水飽和）充分萃取數遍。各有機相分別回收有機溶劑后得各有機相萃取物浸膏，經冷凍干燥，依次得扛板歸石油醚萃取部位（C）、扛板歸氯仿萃取部位（D）、扛板歸乙酸乙酯萃取部位（E）和扛板歸正丁醇萃取部位（F）。殘余的水相經濃縮后，浸膏經冷凍干燥，得扛板歸水相殘余物部位（G）。收集扛板歸不同極性部位A、B、C、D、E、F和G，備用。

1.3 抗氧化實驗

1.3.1 DPPH自由基清除實驗

DPPH自由基清除實驗的方法參照Li[5]報道的方法，稍作改變。用DMSO分別配制濃度為4.0 mg/mL的樣品作為母液。在序列試管中分別加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0 mL 的母液，分別補DMSO至1.0 mL（在反應液中終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。每管加入 3 mL的0.1 mmol/L溶于80%（V/V）乙醇的DPPH溶液（現配現用）；樣品對照組中用80%乙醇代替DPPH溶液；空白組中用DMSO代替樣品溶液。以上各實驗組溶液混勻后，置黑暗處，室溫放置30 min。于517 nm處、1 cm光徑，用1 mL DMSO和3 mL 80%乙醇溶液調零。依次測量各管吸光度值。Vc為陽性對照。每個測試管做兩個平行，結果取平均值。按如下公式計樣品對DPPH自由基百分清除率：DPPH清除率%=100×[A空白–（A樣-A樣對）]/A空白

1.3.2 羥自由基清除實驗

羥自由基清除活性的測定方法參照Motoko[6]報道的方法，稍作改變。用DMSO配制濃度為4.5 mg/mL的樣品作為母液。在序列試管中分別加入0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 4 .5 mg/mL的母液，分別補DMSO至1mL（在反應液中終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）， 即 得序列濃度的樣品組。樣品組中每管依次加入0.5 mL pH7.4 緩沖液、1 mL 7.5 mmoL/L的 1，10-菲啰啉、1.5 mL 0.75 mmoL/L FeSO4 和0.5 mL 3% H2O2后，置于37 ℃水浴中保溫1 h。于536 nm處，1 cm光徑，純化水調零，測量各管吸光度。對照組用1 mL DMSO代替樣品；空白組用1.5 mL DMSO代替1 mL樣品和0.5 mL 3% H2O2。Vc為陽性對照。每個測試管做兩個平行，結果取平均值。按如下公式計樣品對羥自由基百分清除率：

1.4 數據的處理

采用Origin 7.5 數據處理軟件進行數據處理并作圖。

2 結果與討論

2.1 清除DPPH自由基實驗

DPPH自由基屬于有機氮自由基，其結構中含有三個苯環，夾在三個苯環中間有一個氮原子，該氮原子上有一個不成對的單電子。DPPH自由基能穩定地溶解在有機溶劑中，呈深紫色，該溶液在517 nm處有強吸收峰。由于DPPH自由基有單電子的存在，故其能接受一個電子，當溶液中有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的單電子被配對，使其顏色變淺，從而在517 nm處吸光值會下降，且下降程度與配對電子數呈線性關系。因此可采用紫外可見分光光度儀檢測實驗樣品對自由基的清除作用，間接的評價實驗樣品的抗氧化能力[7]。DPPH自由基清除實驗操作簡單、快速的特點，是評價抗氧化活性實驗中應用廣泛的一種實驗方法之一。

扛板歸不同極性部位對DPPH自由基的清除作用見圖1。由圖1可知，各部位的提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，隨著樣品濃度的增大，清除作用也不斷增強，具有一定的量效相關性。當濃度達到1000 ug/mL時，提取部位A、B、C、D、E、F和G的清除率分別達到61.43%、94.08%、86.43%、88.78%、87.43%、91.55%和92.72%。結果表明，扛板歸不同極性部位對DPPH自由基均具有良好的清除能力。

2.2 清除羥自由基實驗

根據化學結構，自由基（Free radical）是指含有未配對電子的原子、分子或基團。目前對以碳、氮和氧為中心的活性基團研究較多，其中對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的研究最為活躍。ROS主要是羥自由基、單線態氧和超氧陰離子等。自由基，其實是人體內正常新陳代謝的產物，一般情況下，自由基在 體內趨于動態平衡。但是當這一平衡失調，自由基就會對機體造成損害，進而引發一系列相關疾病[8]。據文獻報道，由ROS引起的疾病，已超過100余種，如高血壓、癌癥、糖尿病、老癡呆癥、動脈粥樣硬化等疾病[9-10]。抗氧化劑可對體內多余的自由基起到清除作用，控制和減少自由基失衡時自由基對人體造成的損害。

扛板歸不同極性部位對羥自由基清除作用結果見圖2。由圖2可知，提取部位B和提取部位E隨著樣品濃度的增加，對羥自由基清除率也在不斷上升，濃度由25-1000 ug/mL時，清除率分別由0.33% - 93.80%和0.46% - 68.45%。其它極性提取部位的清除作用在該濃度下相對較弱。實驗結果表明，扛板歸提取物對羥自由基有很強的清除活性，活性部位主要集中在水提液醇沉部位（B）和水提液乙酸乙酯萃取部位(E)。

圖1 提取物清除DPPH自由基活性Fig.1 Scavenging activity of extractson DPPHradical

圖2 提取物清除羥自由基活性Fig.2 Scavenging activity of extractsonhydroxyl radical

3 結論

上述實驗結果顯示，扛板歸不同溶劑提取物具有良好的抗氧化活性。抗氧化活性成分主要集中在水提液醇沉部位和水提液乙酸乙酯萃取部位。為中藥扛板歸在臨床上的應用提供實驗理論依據和進一步研究開發扛板歸奠定實驗基礎。