消旋酶法DL-丙氨酸的遺傳毒性研究

王 巖 吳同俊 滕晶晶 楊同金 馮學慶 夏 新

丙氨酸是構成蛋白質的基本單位，是人體的非必需氨基酸，在生理過程中發揮重要的作用，與丙酮酸相互轉化，參與機體葡萄糖循環過程。丙氨酸分為α-丙氨酸/L-丙氨酸，DL-丙氨酸是α-丙氨酸的外消旋體，由等量的左旋體和右旋體構成，無旋光性[1]，為白色透明晶體狀顆粒，無臭無味，鮮味良好，通常作為營養增補劑、調味料應用于食品工業中[2]，即可單獨作為甜味劑來增強化學調味料的調味效果，也可與谷氨酸鈉等制成復合調味品，在醫藥工業上是生產維生素B6和合成氨基丙醇的主要原料。目前，DL-丙氨酸生產工藝主要有化學合成法、直接發酵法及消旋酶法[3-5]。消旋酶法是以L-丙氨酸為原料的酶催化反應，提取工藝簡單，反應速度快，產品收率高，具有良好的應用前景。本研究依據食品安全國家標準(GB15193-2014)[6-8]，擬采用小鼠骨髓細胞微核實驗、小鼠精原細胞染色體畸變實驗和細菌回復突變實驗對消旋酶法DL-丙氨酸的遺傳毒性進行初步評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 消旋酶法DL-丙氨酸(安徽華恒生物公司，AA0415042303)，純度≥99.0%。實驗時，消旋酶法DL-丙氨酸經充分研磨成粉末后用純水配制成10 000、5 000和2 500 mg/kg。

1.1.2 主要試劑 大鼠肝臟微粒體酶S9(齊氏生物公司，20160406)、Dexon(敵克松)(Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，40709)、疊氮鈉(Sigma公司，04202DJ)、2-AF(Sigma-Aldrich公司，00405JD)、1,8-二羥蒽醌(TCI公司，FHF01-LTMJ)、2-氨基蒽(TCI公司，7GCCI-P0)。環磷酰胺(Alfa Aesar公司，K06R045)、秋水仙素(國藥集團化學試劑有限公司，20140423)

1.1.3 實驗動物 SPF級昆明小鼠80只(安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：34000200000776和34000200000825，SPF級動物使用許可證編號：SYXK(皖)2013-006)，體質量25～35 g，周齡7～12周，溫度20～25℃，濕度40%～70%。所有動物實驗前適應性飼養至少3 d，自由飲水、攝食(灌胃前受試動物隔夜禁食)。

1.1.4 實驗用菌 鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535(Molecular Toxicology公司)，正式實驗前經生物學鑒定特性符合實驗要求。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓細胞微核實驗 選取50只昆明小鼠，雌雄各半，按性別采用隨機數字法隨機分5組，每組10只。依據食品安全國家標準(GB15193.5-2014)[6]設消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3個劑量組、陰性對照組(純水)和環磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg，一次性腹腔注射給藥)。間隔24 h 2次經口灌胃染毒，在第2次給藥6 h后，取胸骨骨髓制片，每只動物計數2 000個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte,PCE)，計數有微核的PCE并計算微核細胞率(微核細胞率=微核細胞數/PCE數×1000‰)。

1.2.2 小鼠精原細胞染色體畸變實驗 選取30只雄性昆明小鼠，采用隨機數字法隨機分6組，每組5只。依據食品安全國家標準(GB15193.8-2014)[7]設消旋酶法DL-丙氨酸10 000、5 000和2 500 mg/kg 3個劑量組、陰性對照組(純水)和環磷酰胺陽性對照組(40 mg/kg，一次性腹腔注射給藥)，其中10 000 mg/kg組設24 h組和48 h組。采用經口灌胃一次染毒法，10 000 mg/kg組分別于染毒后24 h和48 h處死各組動物取材，其余各劑量組均在染毒后24 h取樣。動物處死前4 h，腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，取兩側睪丸，剔除脂肪，1%檸檬酸三鈉低滲，甲醇-冰乙酸固定，60%冰乙酸軟化后，染色制片。尋找清晰且分散良好的染色體中期分裂相檢查，每只動物分析100個中期分裂相，記錄染色體數目及結構改變情況，并計算畸變細胞率(畸變細胞率=畸變細胞數/中期分裂相細胞數×100%)。

1.2.3 細菌回復突變實驗(Ames實驗) 依據食品安全國家標準(GB15193.8-2014)[8]，設空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組和5個消旋酶法DL-丙氨酸劑量組。以3.16倍和5倍為組間距，2次實驗消旋酶法DL-丙氨酸劑量分別設50、158、500、1 580、5 000 μg/皿和8、40、200、1 000、5 000 μg/皿。在加代謝活化系統(S9混合液)時選用1,8-二羥蒽醌、2-氨基蒽和2-AF做陽性物，不加S9混合液時選用敵克松和疊氮鈉做陽性物。實驗采用平板摻入法，分別在加和不加S9混合液的條件下進行，每組各做3皿，計數每皿的回變突變菌落數。

2 結果

2.1 小鼠骨髓細胞微核實驗結果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg組PCE微核率與陰性對照組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 小鼠精原細胞染色體畸變實驗結果 消旋酶法DL-丙氨酸10 000 mg/kg、5 000 mg/kg和2 500 mg/kg組動物睪丸精原細胞染色體畸變率、畸變細胞率與陰性對照組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組小鼠骨髓細胞微核實驗結果比較

注：與陰性對照組比較

表2 消旋酶法DL-丙氨酸對小鼠睪丸精原細胞染色體畸變率和畸變細胞率的影響

注：與陰性對照組比較

2.3 Ames實驗結果 所有實驗平皿菌苔生長良好，無明顯可見的沉淀痕跡，對照組每皿回變數均在正常范圍，陽性對照組兩次測試各菌株的回復突變數均大于對照組的2倍以上。消旋酶法DL-丙氨酸各劑量組及溶劑對照組與空白對照組比較，兩次測試各測試菌株的回復突變數均小于對照組2倍，各劑量組之間無劑量-反應關系，測試結果均為陰性。見表3～6。

表3 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實驗結果(第1次，-S9)個)

表4 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實驗結果(第1次，+S9)個)

表5 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實驗結果(第2次，-S9)個)

表6 消旋酶法DL-丙氨酸Ames實驗結果(第2次，+S9)個)

3 討論

甜味劑是能使食物具有甜味的非糖類物質，作為一大類食品添加劑廣泛應用于食品工業中，具有品種多、數量大、應用廣等特點，但其安全性問題也一直是社會關注的焦點[9]，隨著研究的深入，各種甜味劑的毒性效應被發現，長期飲用阿斯巴甜飲料能顯著增加患淋巴瘤和白血病危險性[10]，王虹等[11]研究發現甜蜜素和蛋白糖對于小鼠有致突變作用，精子畸形率和骨髓微核率均顯著高于對照組。消旋酶法DL-丙氨酸作為一種新型的食品添加劑，不僅可以作為甜味劑，也可用于營養強化劑和調味品，由于其生產工藝簡單、設備投資少、三廢排放少，使其大規模生產和應用成為可能[12]。

本研究結果表明，各劑量消旋酶法DL-丙氨酸沒有對骨髓紅細胞造成明顯的抑制作用，未見其對小鼠體細胞或生殖細胞具有遺傳毒性或致突變作用，且無論是否存在代謝活化系統，消旋酶法DL-丙氨酸對五組組氨酸缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 均未顯示出任何致突變作用，前期急性經口毒性實驗結果也顯示消旋酶法DL-丙氨酸對大、小鼠急性經口LD50雌、雄性均大于10 000 mg/kg，屬實際無毒類，可以認為消旋酶法DL-丙氨酸作為一種食品添加劑是基本安全的，與國內研究[13]基本一致。陳耿等[14]對發酵法L-丙氨酸進行了90天經口毒性實驗發現雌、雄大鼠實際攝入的最大未觀察到有害作用劑量分別為5.56、4.58 g /kg ( 分別相當于推薦劑量的332 和274 倍) ，對于消旋酶法DL-丙氨酸廠家提供的成人推薦劑量(1.0 g/d)長期使用是否安全還需進行亞急性、亞慢性毒性實驗以進一步評估其安全性。