角膜共焦顯微鏡在真菌性角膜炎診療中的應用價值探討

姜麗麗 王 勇 史春生 詹 邶 李 晶

真菌性角膜炎早期診斷困難，缺乏有效的治療措施，且大部分患者預后不良，是嚴重的致盲眼病之一。研究[1-2]發現，真菌性角膜炎發病率有逐年上升趨勢。目前臨床上應用的抗真菌藥物主要包括多烯類、唑類、烯丙胺類、還有氟胞嘧啶類等藥物。Garg等[3]認為，在長期使用抗真菌藥物治療的患者中，有9.0%～26.3%的患者角膜形態學發生改變，這可能與藥物的眼部毒性作用有關。因此，盡早確診、及時使用抗真菌藥物治療及準確把握停藥時機對真菌性角膜炎患者至關重要[4]。共焦顯微鏡能夠對活體組織進行無創性檢查，并已廣泛應用于眼科。本研究收集真菌性角膜炎患者21例，通過對實驗室、角膜共焦顯微鏡檢查結果及患者復診時共焦顯微鏡檢查的菌絲殘留情況進行研究，評估共焦顯微鏡在真菌性角膜炎診療中的應用價值，以期對臨床工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年1月安徽省第二人民醫院診治的真菌性角膜炎典型表現患者21例(21眼)，所有患者均行角膜共焦顯微鏡檢查和實驗室真菌涂片檢查，其中男性13例(13眼)，女性8例(8眼)，年齡36～80歲，平均(62.50±16.27)歲。以上患者行裂隙燈檢查可見以下體征中至少1項：白色致密的角膜浸潤病灶，并可合并免疫環、偽足、衛星灶、角膜后沉著物、前房積膿等；裂隙燈檢查排除合并細菌性角膜炎或病毒性角膜炎患者以及其他角膜變性和營養不良等疾病。所有患者均未使用過抗感染或抗真菌藥物。診療過程中患者均積極配合治療，無一例隨訪缺失。

1.2 方法

1.2.1 角膜共焦顯微鏡檢查方法 在進行角膜刮片以前，每例患者先行角膜共焦顯微鏡檢查。采用以鹵素燈為光源的角膜共焦顯微鏡，放大1 000倍，分辨率1 μm，物鏡與角膜的安全距離為1.98 mm，以卡波姆凝膠為介質。采用自動模式，對角膜全層兩次掃描，掃描間隔1.50 μm，共獲得350幅圖像。在病灶中央，病灶邊緣內側1 mm處3點、6點、9點、12點處分別檢查5次，檢查陰性的患者再次檢查，3次結果均陰性視為檢查結果陰性。篩選需要的圖像存盤[5]。

1.2.2 角膜刮片實驗室檢查方法 0.05%鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcon，16K17CA)表面麻醉后，5 mL注射器針頭先拭去潰瘍面附著壞死組織及膿性分泌物，刮取潰瘍邊緣組織于載玻片，即刻送實驗室行染色鏡檢。鏡檢陰性的患者再次刮片檢查，3次鏡檢結果均陰性視為實驗室檢查陰性。

1.2.3 治療方法 所有患者均使用5%那他霉素眼用混懸液(Alcon，H20080104)局部點眼，潰瘍灶大于5 mm，伴有嚴重的前房反應或者積膿者，加用抗真菌藥物口服或靜滴，輔以擴瞳、營養角膜、消炎、補充大劑量維生素等治療。抗真菌治療有效的患者在隨診過程中行角膜共焦顯微鏡檢查，以臨床癥狀體征陰性與共焦顯微鏡檢查無菌絲殘留作為停藥標準。患者分別在治療后1周、2周、1個月、3個月及6個月，采用門診復查的方式進行隨訪。

1.3 療效評估標準 治愈：疼痛癥狀消失，角膜潰瘍愈合，熒光素染色陰性，前房積膿消失；好轉：疼痛癥狀明顯減輕，角膜潰瘍部分愈合，前房積膿減少或者消失，熒光素鈉染色(±)；無效：疼痛癥狀無改善，角膜潰瘍擴大或穿孔，前房積膿加重，結膜囊分泌物涂片鏡檢有真菌菌絲[6]。

2 結果

2.1 角膜共聚焦顯微鏡及角膜刮片實驗室檢查結果 實驗室與角膜共焦顯微鏡檢查均為陽性者11例(52.38%)，實驗室檢查陰性而共焦顯微鏡檢查陽性者7例(33.33%)，共焦顯微鏡檢查陰性而實驗室檢查陽性1例(4.76%)。共焦顯微鏡檢出率為85.71%，實驗室檢出率為57.14%，2種方法檢出率的差異有統計學意義(P=0.043)。檢查情況見圖1、2。

圖1 鏡檢可見細長分枝狀結構菌絲，呈深紫紅著色(黑箭頭)(革蘭染色×400)

圖2 角膜共焦顯微鏡檢查，菌絲直徑為3～6 μm

注：A為在深層角膜基質中可見粗大的神經纖維走形筆直，較上皮下神經纖維粗大(黑箭頭)，而真菌菌絲呈現細、短的扭曲走形(白箭頭)，旁邊可見高反光樹突狀及炎性細胞；B為在淺層角膜基質中可見真菌菌絲呈高反光扭曲環狀(白箭頭)，周圍環繞大量的炎癥細胞(黑箭頭)，伴有高反光的壞死組織；C為在角膜基質中可見大量分支狀高反光菌絲(白箭頭)，周圍是高反光激活態基質層細胞；D為在角膜基質中可見大量竹節狀菌絲，粗細不均，排列雜亂(白箭頭)，伴有大量炎癥細胞浸潤(黑箭頭)

2.2 治療結果 21例患者中，8例(38.10%)患者藥物治療效果不佳，5例(23.81%)接受結膜瓣遮蓋，術后繼續使用抗真菌藥物治療，2例(9.52%)轉外院行角膜移植手術，1例(4.76%)患者因感染不能控制發展為全眼球炎行眼球摘除術。治療好轉13例(61.90%)，均留有角膜瘢痕，在治療后1周、2周、1個月、3個月及6個月隨訪過程中，同時滿足癥狀體征陰性者與角膜共焦顯微鏡檢查無菌絲殘留為停藥標準，半年跟蹤隨訪時間內均未見感染復發。有4例(19.05%)患者在癥狀體征陰性時，角膜共焦顯微鏡檢查仍可見基質層菌絲殘留，繼續使用藥物治療至角膜共焦顯微鏡檢查轉陰性。

3 討論

活體角膜共焦顯微鏡因具備無創、可靠、快速診斷的優點，在真菌性角膜炎的診斷和治療中具有獨特的優勢。在角膜共焦顯微鏡的幫助下，真菌性角膜炎患者可以實現早發現、早診斷、早治療，從而避免嚴重并發癥的出現。鹵素燈和激光角膜共焦顯微鏡在角膜疾病的診斷中各具優勢，激光共焦顯微鏡光源穿透性更佳，適用于對炎癥水腫組織的觀察，因此被推薦作為角膜炎癥診斷的首選。本研究使用鹵素燈共焦顯微鏡來觀察疑是真菌感染的活體角膜組織，因為鹵素燈共聚焦顯微鏡可以從上皮到內皮反復掃描，間隔1.50 μm可以獲得1幅圖片，1次掃描可以獲得350張圖片，如果發現真菌菌絲，再結合實驗室檢查，即可做出快速診斷。而激光共焦顯微鏡1次掃描僅能探測60 μm的深度，且探頭和患者角膜相接觸，加重真菌性角膜炎的患眼疼痛感，無法取得部分患者的配合，影響檢查結果；同時共聚焦顯微鏡也已成功應用在阿米巴性角膜炎的早期診斷和治療中[7]。據國外報道[8]，1/3的角膜潰瘍實驗室檢查是陰性的，因此共聚焦顯微鏡在角膜疾病中的運用有助于早期快速鑒別診斷角膜潰瘍。

本研究中，共焦顯微鏡的檢出率為85.71%，而實驗室檢查檢出率僅為57.14%。共焦顯微鏡的檢出率高于實驗室檢出率，其檢出率接近西方國家的報道的80%～94%[9-11]。在治療好轉后癥狀體征均為陰性的隨診患者中，仍有4例患者行共焦顯微鏡檢查檢出真菌菌絲，表明根據臨床癥狀和體征來制定停藥時機是不可靠的，停藥后該類患者仍有可能會復發。停藥時機應該在臨床癥狀體征、實驗室檢查結果及角膜共焦顯微鏡檢查結果相結合的情況下做出判斷。對于經過治療已形成角膜瘢痕的患者，尤其應該注意對瘢痕周邊纖維化甚至透明的角膜組織進行共焦顯微鏡掃描。

本研究同時運用共焦顯微鏡Z掃描模式對真菌菌絲在角膜組織中的深度進行定位，發現部分患者的內皮上仍然發現菌絲，這可能是部分真菌角膜炎患者即使進行板層角膜移植后仍然復發的原因，這部分患者可能需要行穿透性角膜移植治療。在未來的臨床工作中，筆者將對共焦顯微鏡Z掃描模式在真菌性角膜炎的治療中的運用進行深入探索。