人乳頭瘤病毒16和52型雙熒光等溫多自配引發擴增的檢測方法

崔玉偉, 牟 穎, 馬 莉, 丁 雄, 方宗宇, 王 焰, 吳青青

(1. 貴州醫科大學附屬醫院 中心實驗室, 貴陽 550004；2. 浙江大學 工業控制技術國家重點實驗室, 智能系統與控制研究所, 分析儀器研究中心, 杭州 310058)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一, 高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持續感染是導致宮頸癌的關鍵因素[1-4]. 目前, 檢測HPV的方法主要有: Ⅱ代雜交捕獲技術(HC Ⅱ試驗)[5-6], PCR(多聚酶鏈式反應)-反向點雜交技術[7], 實時熒光定量PCR技術[8]等. 但上述方法均存在無法對HPV分型, 實驗步驟繁瑣、耗時長、存在交叉式污染以及試劑盒造價高等缺點. 因此, 開發一種操作簡單、快速且價格低廉的HPV基因分型檢測方法具有重要意義.

等溫多自配引發擴增(IMSA)技術[9]是一種新型等溫核酸擴增技術. IMSA技術使用6條特異性引物識別靶序列中7個基因區段, 在等溫(60～65 ℃)條件下進行擴增反應, 整個檢測反應僅需1 h. 該技術較PCR具有靈敏度高、特異性強、無需溫度循環、檢測時間短、成本低以及結果易判讀等優點[10-11]. 浙江大學微流控制研究組開發的一種羥基萘酚藍(HNB)和SYBR GreenⅠ混合雙熒光指示劑已被證明可用于IMSA檢測, 且比單一金屬離子指示劑或單一DNA染料具有更好的指示性能, 并已成功檢測乙肝病毒[10,12]. 在雙熒光指示劑中, HNB和SYBR GreenⅠ的合理配比是實現等溫擴增及結果明確判斷的前提. 本文應用IMSA技術， 針對HPV的16和52型基因序列設計6條特異性引物， 通過在檢測體系中加入HNB和SYBR雙熒光指示劑， 優化控制條件， 進行閉管檢測， 以減少氣溶膠污染, 用微量IMSA檢測體系以降低試劑成本. 結果表明， 該方法適用于檢測中國人常見的高危HPV16和HPV52型人乳頭瘤病毒.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

ABI 7900HT型定量PCR儀(美國ThermoFisher公司); 小動物體內熒光成像系統(美國CRI Maestro公司). Bst WarmStart2.0 DNA聚合酶(8 U/μL, 1 U=1 μmol/min)、dNTPs(10 mmol/L)、MgSO4(100 mmol/L)和10×Isothermal buffer(20 mmol/L Tris-HCl, 2 mmol/L MgSO4, 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 0.1%Tween-20)均購自NEB(北京)有限公司; SYBR GreenⅠ和去核酸酶無菌水購自美國Life Technologies Ltd公司; 羥基萘酚藍購自Lemongreen(上海)公司; 甜菜堿購自英國Sigma-Aldrich 公司; 21種HPV分型檢測試劑盒和DNA提取試劑盒購自廣東凱普生物化學有限公司.

1.2 IMSA引物的設計

從GenBank中下載HPV16E7和HPV52E6基因序列, 并用MEGA7軟件進行分析, 定位差異明顯的序列片段, 先用在線引物設計軟件Primerexplorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)進行引物設計, 再根據IMSA引物設計原則[13]進行適合IMSA技術的改進, 篩選出最優引物組. IMSA包含6條引物, 分別為DsF,DsR,FIT,RIT,SteF和SteR. DsF和DsR為外引物, DsF由SteR和F3組成, DsR由SteF和R3組成; FIT和RIT為內引物, FIT由Tc和F2組成, RIT由T和R2組成； SteF和SteR為莖引物； SteRc與SteR、T與Tc、R2c與R2是反向互補序列. 引物由生工生物工程(上海)公司合成. HPV16和HPV52目的基因序列及引物識別靶點如圖1所示. 引物序列組成列于表1.

表1 IMSA引物序列

1.3 HPV質粒的構建

HPV16和HPV52的DNA標準品是克隆含有HPV16型E7基因和HPV52型E6基因部分序列的pUC57質粒, 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并驗證. 克隆后質粒全長3 100 bp, 其中目標序列長為390 bp. 測定克隆質粒在260 nm處的吸光度(OD260 nm)值, 并根據

按凱普DNA提取試劑盒說明書提取7份已知單重感染HPV6,HPV16,HPV18,HPV39,HPV52,HPV58,HPV59的宮頸刮片標本DNA. 將1 μL提取的DNA加入已優化的雙熒光IMSA反應體系, 輕輕振蕩混勻, 利用實時熒光PCR儀進行擴增(63 ℃, 60 min), 并記錄實時擴增曲線. 反應結束后用熒光成像系統采集圖像(激發波長為455 nm的藍光), 根據反應管的顏色判斷是否擴增, 陽性管呈黃綠色, 陰性管呈橘紅色.

純化和定量后的HPV16和HPV52質粒進行系列稀釋至1.2×105,1.2×104,1.2×103,600,120,60,6拷貝/μL, 將1 μL系列稀釋的質粒加入已優化的雙熒光IMSA檢測體系, 利用實時熒光PCR儀進行擴增(63 ℃, 60 min)并記錄擴增曲線, 靈敏度實驗重復3次. 反應結束后, 進行熒光圖像采集.

1.4 雙熒光IMSA檢測方法的建立

建立如下10 μL反應體系： 1 μL DNA模板, 1 μL 10×Isothermal buffer, 0.2 μL 10μmol/L的外引物DsF和DsR, 0.4 μL 20 μmol/L的內引物FIT和RIT, 0.4 μL 40 μmol/L1的莖引物SteF和SteR, 1.4 μL的dNTPs, 0.4 μL的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶, 1.6 μL 5 mol/L的甜菜堿, 0.6 μL的硫酸鎂, 0.2 μL SYBR GreenⅠ(1∶200), 0.2 μL HNB, 剩余體積用去核酸酶無菌水補足.

103份疑似HPV感染病人的宮頸刮片標本由貴州醫科大學附屬醫院提供, 按凱普DNA提取試劑盒說明書提取宮頸刮片標本DNA, 同時用本文建立的雙熒光IMSA方法與HPV分型試劑盒檢測.

圖2為不同濃度HNB與1∶10 000 SYBR GreenⅠ組成混合雙熒光指示劑在IMSA反應液中的熒光光譜和雙熒光顯色結果. 由圖2可見, 含有雙熒光指示劑的陽性和陰性IMSA反應液熒光光譜在500～650 nm內存在明顯的兩個熒光強度峰, 分別在540,610 nm處. 其中, 340 μmol/L HNB與SYBR GreenⅠ混合時陰陽性反應間的熒光顏色變化最清晰, 表現為陽性反應管雙熒光顯色為黃綠色, 陰性反應管為橘紅色. 表2為不同濃度HNB組成的雙熒光指示劑評價結果. 由表2可見, 340 μmol/L HNB的評價指標值為2 953, 明顯大于120，420 μmol/L HNB的值, 表明340 μmol/L HNB為最優濃度. 該結果與文獻[10]的優化結果及肉眼觀察結果一致.

玉米種植過程中發生的病蟲害需要及時治理，以免影響其他植株的正常生長，農戶應盡量采用物理、化學及生物相結合的方式來處理。針對玉米的葉莖根等的病蟲害要及時的噴灑適量的農藥，緩解植株的病變情況。另外及時將病變的較為嚴重的植株從根清理掉，避免腐爛的植株通過土壤、空氣等途徑將細菌傳播至其他健康的植株。最后通過在玉米植株上放置赤眼蜂、蘇云金菌及蘇云金桿菌乳劑等來達到防治病蟲害的目的。

1.5 IMSA特異性驗證

計算克隆質粒的DNA拷貝濃度(拷貝/μL), 將克隆質粒進行系列稀釋備用.

1.6 IMSA靈敏度檢驗

第三個“1”是指以100萬噸工業級、食品級磷酸為基礎，做100萬噸精細化工產品，包括飼料添加劑、食品和醫療產品、電子材料等，把磷產業鏈向價值高端延伸。

1.7 臨床標本的檢測及比對

根據原因制定組合干預措施,包括:①開展全院手衛生培訓,強化手衛生意識。②走廊、床旁等地方增設手衛生設施。③科主任及護士長每周一晨會親自演練七步洗手法,強調手衛生。④將手衛生依從率納入到院感質控中單獨立項。

2 結果與分析

2.1 雙熒光指示劑優化

在反應體系中, HNB和SYBR GreenⅠ構成雙熒光指示劑. 為優化雙熒光檢測體系中指示劑的質量濃度, 將終濃度為1∶10 000的SYBR GreenⅠ分別與不同濃度的HNB(終濃度分別為120,340,420 μmol/L)進行組合, 以確定指示劑最佳配比. 優化雙熒光指示劑使用的DNA模板為1.2×104拷貝/μL的HPV52質粒； 反應管置于ABI 7900 HT型實時熒光定量PCR儀中, 63 ℃恒溫反應60 min. 每濃度組設3個平行管, 同時設置陰性對照(以等體積的去核酸酶無菌水代替DNA模板在相同條件下反應). 反應結束后用熒光成像系統進行發射光譜分析, 設定激發波長為455 nm的藍光, 曝光時間5 s, 分別對陽性和陰性反應液進行熒光成像, 并分析其500～650 nm步長為10 nm的發射光譜特征, 重復測試3次. 使用最優HNB濃度評價標準[10], 并將其簡化為一個評價指標; 記錄并分析陽性和陰性反應液于540,610 nm的熒光強度, 分別記為FI540(陽性)、FI610(陽性)、FI540(陰性)和FI610(陰性); 簡化的評價指標為兩組數據之差, 第一組數據等于平行3次測試陽性反應液(FI540-FI610)的均值, 第二組數據等于平行的3次測試陰性反應液(FI610-FI540)的均值. 評價指標值越大, 陰性和陽性反應管區別越明顯.

本文基于多源數據，采用假設檢驗方法實證研究了我國兩化融合績效情況，并探索性地分析了兩化融合在加強企業價值創造能力、推動行業綜合發展、提升經濟發展質量等方面績效產生的機理，得出以下3點結論：

“好運”（Fortuna buona）是“坐著的女子，右臂靠在輪轂上——天球的替代物，左手拿著豐饒角。 ”（圖 5）而“厄運”（Fortuna infelice）展現的場景則是：“好在一艘沒有舵的船上，帆與樹都已被風摧折。”

陽性反應: IMSA對1.2×104拷貝/μL HPV52質粒DNA分子擴增； 陰性反應： IMSA對去核酸酶無菌水(代替DNA模板)擴增.圖2 雙熒光指示劑在IMSA反應液中的熒光光譜和雙熒光顯色結果Fig.2 Fluorescence spectra and dual fluorescence chromogenic results of dual fluorescence indicator

ρ(HNB)/(μmol·L-1)反應類型?熒光強度??測試1測試2測試3差值1???差值2差值3差值平均值差值SDCV/%評價指標120FI540(陰)2 2712 3912 081-781-683-471-645158-24.5997FI610(陰)1 4901 7081 610FI540(陽)2 7422 6392 6861 6511 5971 6801 643422.6FI610(陽)1 0911 0421 006340FI540(陰)9568069141 7411 7641 7891 764241.42 953FI610(陰)2 6972 5702 703FI540(陽)2 8632 7682 6741 1641 2031 1981 188211.8FI610(陽)1 6991 5651 476420FI540(陰)5735235512 1302 0122 1522 098763.62 249FI610(陰)2 7032 5352 703FI540(陽)2 4072 2402 072202178751526744.3FI610(陽)2 2052 0621 997

*陽性反應： IMSA對1.2×104拷貝/μL HPV52質粒DNA分子擴增； 陰性反應： IMSA對去核酸酶無菌水(代替模板)進行擴增； **FI540和FI610為藍光激發5 s時在540,610 nm處熒光強度值; ***差值： 陰性反應=FI610-FI540, 陽性反應=FI540-FI610.

2.2 IMSA檢測HPV16和HPV52型的特異性

對7份已知單重感染HPV6,16,18,39,52,58,59亞型的樣品DNA進行IMSA特異性分析, 結果如圖3所示. 其中： 圖3(A)和(C)分別為HPV16檢測結果的雙熒光顯色圖和實時熒光曲線； 圖3(B)和(D)分別為HPV52檢測結果的雙熒光顯色圖和實時熒光曲線. 反應管內橘紅色表示檢測陰性, 黃綠色表示檢測陽性. 由圖3(A)可見, 僅添加HPV16 DNA模板的反應管出現陽性擴增(第3孔, 黃綠色)； 由圖3(B)可見, 僅添加HPV52 DNA模板的反應管出現陽性擴增(第6孔, 黃綠色). 圖3(A)和(B)顏色改變反映的擴增情況與圖3(C)和(D)實時熒光曲線結果一致.

1. 陰性對照(模板為去核酸酶無菌水); 2. HPV6 ; 3. HPV16; 4. HPV18; 5. HPV39; 6. HPV52; 7. HPV58; 8. HPV 59.圖3 IMSA檢測HPV16和HPV52型特異性的雙熒光顯色結果及實時熒光曲線Fig.3 Specificities of dual fluorescence chromogenic results and real-time fluorescence curves of IMSA detection of HPV16 and HPV52

2.3 IMSA檢測HPV16和HPV52型的靈敏度

1～8: 1.2×105,1.2×104,1.2×103,600,120,60,6,0拷貝/μL.圖4 IMSA檢測HPV16和HPV52型靈敏度的雙熒光顯色結果及實時熒光曲線Fig.4 Sensitivities of dual fluorescence chromogenic results and real-time fluorescence curves of IMSA detection of HPV16 and HPV52

對系列稀釋的HPV16和HPV52模板質粒進行IMSA檢測, 質粒濃度依次為6,60,120,600,1.2×103,1.2×104,1.2×105拷貝/μL, 結果如圖4所示. 由圖4(A)可見, DNA拷貝數為6拷貝的反應管及陰性對照管呈橘紅色, DNA拷貝數大于等于60拷貝時反應管為黃綠色, 與圖4(C)實時熒光曲線記錄的結果一致. 由圖4(B)可見, 每反應管病毒DNA拷貝數小于等于120拷貝時反應管為橘紅色, 每反應管病毒DNA拷貝數大于等于600拷貝時反應管為黃綠色, 與圖4(D)實時熒光曲線記錄的結果一致. 上述結果表明, 雙熒光IMSA方法對HPV16和HPV52檢測具有較高的靈敏度, 對HPV16和HPV52的檢測下限分別為60拷貝/μL和600拷貝/μL.

2.4 臨床標本檢測

對103份宮頸刮片標本DNA進行特異性IMSA檢測, 結果表明, 17份為HPV陰性, 45份為HPV16陽性(檢出率43.69%), 41份為HPV52陽性(檢出率39.81%). 采用凱普21種HPV分型試劑盒(PCR+膜雜交法)對103份臨床HPV樣本檢測, 結果表明, 12份為HPV陰性, 45份為HPV16陽性, 41份為HPV52陽性, 5份為其他亞型樣本. 可見， 本文檢測HPV16和HPV52型的雙熒光IMSA方法與臨床現有方法相比, 具有極高的符合率.

3 討 論

高危型HPV的持續感染是引發宮頸癌的關鍵因素, 因此早期發現HPV感染是預防宮頸癌的關鍵. HPV16和HPV52是中國人常見的高危HPV亞型, 90%的宮頸癌與HPV16的持續感染有關[14-15]. 本文建立的基于雙熒光IMSA方法檢測HPV16和HPV52型分別針對HPV16E7基因和HPV52E6基因設計6條特異性引物識別靶序列7個基因位點, 特異性顯著高于普通PCR(兩條引物與靶序列結合). 同時, 在鏈置換DNA聚合酶的作用下, 恒溫條件下完成反應, 對實驗設備的要求較低, 與PCR相比, 反應時間縮短一倍以上. 等溫擴增反應極易受氣溶膠污染, 導致假陽性[13], 而雙熒光指示劑可在反應前加入反應體系, 實驗操作簡單, 無需開蓋檢測, 避免了氣溶膠污染(若PCR管氣密性欠佳, 則可在反應液上方加2 μL石蠟油), 靈敏度比文獻[16]用鈣黃綠素或單一HNB指示劑方法的提高10倍以上. 這種雙熒光指示劑的機理是HNB與 SYBR GreenⅠ介導的熒光均可被455 nm藍光激發; SYBR GreenⅠ可嵌入雙鏈DNA小溝發出綠色熒光； HNB是一種良好的金屬離子指示劑, 與鎂離子結合后發出紅色熒光. 在IMSA反應過程中不斷產生的DNA雙鏈使SYBR GreenⅠ介導的綠色熒光不斷增強, 同時IMSA反應過程中不斷產生焦磷酸鎂的沉淀， 使HNB介導的紅色熒光不斷減弱. 這種雙重熒光信號放大的機制使陰性管和陽性管顏色的差異顯著大于基于自然光顏色變化的可視化檢測[10], 由于采用穩定的藍光作為激發光源, 因此受環境因素(如結果讀取時周圍光線強弱)及主觀因素的影響較小. 經優化后雙熒光指示劑的終濃度為340 μmol/L HNB和1∶10 000 SYBR GreenⅠ, 雙熒光的復合效應使陽性反應管顯色為黃綠色, 陰性反應管為橘紅色. 本文將繁瑣的雙熒光評價標準簡化為一個評價指標, 有利于雙熒光指示劑檢測其他病原體或微生物. 由于IMSA反應在60～65 ℃恒溫下均可發生, 因此一般的水浴鍋即可滿足實驗要求, 操作簡單, 便于推廣. 本文建立反應體系的總體積為10 μL, 比常見的25 μL等溫反應體系[17]減少試劑消耗60%, 大幅度降低了診斷試劑成本. IMSA方法的靈敏度較高, 對HPV16和HPV52型的檢測限分別達60,600拷貝/μL, 基本與實時PCR靈敏度相當[8], 比其他等溫擴增方法的靈敏度約高10～20倍[18]. 對已知單重感染HPV6,16,18,39,52,58,59型的臨床樣本進行特異性分析及對103例臨床標本的檢測結果與商品化試劑盒檢測結果無差異, 表明此方法的特異性高, 未發生交叉反應.

綜上所述, 本文建立的應用于HPV16和HPV52分型檢測的雙熒光IMSA方法為HPV基因分型檢測提供了一種敏感、特異、快速、廉價的新方法, 具有推廣價值.