胰腺導管細胞癌組織CSF3R基因表達對患者預后的影響及其機制

方天逸，王宇夫，林軒，王浩，崔云甫

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150001)

近年來，表觀遺傳學關于胰腺癌的研究取得了巨大進步，“炎癌轉化”假說已經得到廣泛認可[1]。腫瘤組織中的炎性細胞，特別是嗜中性粒細胞是目前研究的熱點[2]。學者們致力于尋找與嗜中性粒細胞高度相關，甚至可在一定程度上代表腫瘤組織內嗜中性粒細胞募集程度的基因。慢性中性粒細胞白血病是一種以血液中嗜中性粒細胞惡性增多為主的疾病，主要由粒細胞集落刺激因子3受體(CSF3R)基因突變導致[3]。CSF3R不僅在骨髓中高表達，在膽囊、肺臟、膀胱、腎臟等組織也被檢測到不同程度的表達[4]。目前CSF3R基因在實體腫瘤中作用的研究剛剛起步。2017年12月～2018年2月，本研究通過公開數據庫GEO中的芯片數據，利用R2平臺，采用生物信息學技術方法分析了CSF3R與胰腺導管細胞癌患者總體生存率的關系，并分析其相關的作用機制和信號通路，旨在為進一步深入研究CSF3R基因與胰腺導管細胞癌的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載基因表達譜公共數據集GSE21501，此數據集包含CSF3R表達數據的人類胰腺導管細胞癌表達譜，包括132例份胰腺導管細胞癌患者的癌組織標本(30例份標本無生存資料)，分別來自北卡羅來納大學教堂山分校、西北大學紀念醫院、北岸大學、內布拉斯加醫學中心和霍普金斯醫療機構等醫療機構。其中原發性胰腺癌117例，轉移性胰腺癌15例。T分期：T1期2例，T2期18例，T3期90例，T4期2例；N分期：N0期34例，N1期81例；M分期：M0期116例，M1期15例；分化程度：低分化5例，中分化55例，高分化51例；切緣陽性16例、陰性63例；新輔助治療113例。注：內布拉斯加醫學中心的15例份標本缺失T分期、N分期、分化程度、切緣情況、新輔助治療等資料；霍普金斯醫療機構的34例份標本缺失切緣情況資料。

1.2 實驗方法 采用Allprep試劑盒(Qiagen)從快速冰凍腫瘤組織中提取癌細胞RNA，納升分光光度計定量Bioanalyzer2100評估RNA質量。利用R2分析平臺(http://r2.amc.nl)進行基因表達情況與生存數據的相關性運算，通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析及Gene Ontology(GO)分析方法對CSF3R的相關基因通路進行初步分析。生存數據的處理采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSF3R表達與患者總體生存率的關系 CSF3R高表達患者62例，低表達患者40例；CSF3R表達水平與患者的總體生存率呈負相關(P=0.015)，高表達患者的總體生存率低于低表達患者(P<0.05)。見圖1。

圖1 CSF3R表達與患者總體生存率的關系

2.2 與CSF3R相關的基因 利用R2分析平臺，對數據集GSE21501中132個胰腺導管細胞癌患者的全部基因進行統計學分析，檢測出與CSF3R表達呈顯著相關的基因共6 521個，其中正相關基因3 040個、負相關基因3 481個，前20位正負相關基因見表1。

表1 與胰腺導管細胞癌患者CSF3R表達呈正負相關的前20位基因

2.3 基因通路 KEGG分析發現，與CSF3R相關的6 521個基因中，有1 943個基因涉及不同的信號通路。當取P<0.001時，27個CSF3R高表達基因(C1QA、C1QB、C1QC、C2、C3AR1、C5、C5AR1、FCAR、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCGR3B、FGG、FPR1、FPR2、FPR3、HLA-DMB、HLA-DQA1、HLA-DQB1、ICAM1、ITGAM、ITGB2、MASP1、MASP2、MBL2、PLG、SELPLG)僅涉及1個信號通路，即金黃色葡萄球菌感染。GO分析發現，CSF3R及其相關基因主要與細胞對刺激的反應、免疫反應、RAS調控、胰腺發育等相關。見表2。

表2 與胰腺導管細胞癌患者CSF3R相關基因的GO分析

3 討論

胰腺導管細胞癌的惡性程度遠高于其他實體腫瘤[5]。胰腺癌具有特殊的解剖結構以及復雜的腫瘤微環境，腫瘤組織長期處于缺血和低氧環境，腫瘤細胞具有高度的異質性和異常的代謝模式[6]，但這些尚不能充分解釋胰腺癌的發病機理。隨著研究的不斷深入，胰腺癌組織全基因組測序技術的成熟和分子生物學的長足發展，為更深層次了解胰腺癌的生物學特征提供了條件，推動了胰腺癌早期診斷和特異性靶向治療的發展。

CSF3R是一種蛋白質編碼基因，又名粒細胞集落刺激因子受體，位于1號染色體的p34區，由17 272個堿基構成，有19個外顯子。該基因可以調控粒細胞的生成、分化和信號傳導[7]。CSF3R基因起初被認為在粒細胞的生長和發育中發揮重要作用[8]。Maxson等[9]發現血液系統腫瘤中CSF3R突變，揭開了其在血液系統腫瘤研究的序幕。目前認為，CSF3R突變與重度先天性中性粒細胞減少癥關系密切，可誘發其發展為急性髓細胞白血病(AML)[10]。CSF3R突變包括CSF3R T618I和CSF3R T615A兩種類型，常合并SETBP1基因突變[11]。

本研究對選取的芯片數據進行Kaplan-Meier生存曲線分析證實，CSF3R對于胰腺導管細胞癌患者的總體生存期有明顯的預測作用，CSF3R高表達患者的總體生存期明顯短于低表達患者。盡管數據庫中有30例患者生存資料缺失，但仍提示CSF3R是一個明顯的促癌因素。本研究通過R2分析平臺檢測出與CSF3R表達顯著相關的基因共6 521個，經計算與其高度正相關的部分基因均發揮不同程度的促癌作用。Hou等[12]報道，FPR2表達水平與胃癌惡性程度、淋巴結轉移情況呈正相關；Wang等[13]報道，CXCR2在胃癌細胞的增殖和侵襲中起重要作用。對這6 521個基因的KEGG分析結果顯示，CSF3R高表達時僅涉及金黃葡萄球菌感染信號通路。Wang等[14]認為，胰腺癌組織中炎性細胞浸潤程度越高，患者預后越差；Bayne等[15]報道，腫瘤來源的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是胰腺癌組織內炎癥和免疫抑制的重要調節劑。葡萄球菌感染灶內主要的炎性細胞為中性粒細胞。我們推測CSF3R高表達導致患者總體生存率降低可能與中性粒細胞的三種殺傷途徑有關，即吞噬、脫顆粒和中性粒細胞外網(NETs)。在吞噬過程中，為了消除和降解微生物，活性氧(ROS)、防御素和絲氨酸蛋白酶在吞噬體中釋放。ROS的持續釋放導致由中性粒細胞局部浸潤的組織微環境持續缺氧，而慢性持續性低氧環境在胰腺導管細胞癌的發生、侵襲和轉移中發揮重要作用。Abdol Razak等[16]研究表明，胰腺癌細胞會刺激周圍中性粒細胞產生NETs，而NETs可促進ROS對腫瘤組織及其間質的殺傷作用，進而誘導多種致癌因子的產生。Geller等[17]研究發現，胰腺癌對吉西他濱產生耐藥是由于腫瘤組織中存在可以產生胞苷脫氨酶的特異性細菌；這些細菌可以代謝化療藥物，并募集中性粒細胞，使腫瘤產生耐藥性，這也從一個新的角度闡釋了細菌、炎癥和腫瘤相互促進的關系。本研究 GO分析結果顯示，CSF3R與其相關基因在細胞炎癥反應中發揮了一系列功能，如免疫反應、白細胞激活等。此外，其激活的ErbB信號通路也可以調控直腸癌細胞的增殖、浸潤和轉移[18]。在本研究數據集中CSF3R高表達導致胰腺癌患者不良預后，該結果為今后研究CSF3R在胰腺癌發展中作用的相關機制提供了思路。

轉錄組學的發展使臨床對胰腺癌有了新的認識。轉錄組學與目前的細胞學研究不同，其雖可在短時間內檢測到人類細胞或組織中所有基因的轉錄表達，但這種通過公共平臺的分析方法無法描述細胞間化學相互作用的真實情況。其次，其統計結果只適用于群體患者，而不適用于單一患者，因此需要更大的樣本量進行進一步的研究。通過公共基因芯片數據進行分析，具有快捷、簡便、樣本量大的優勢。本研究中CSF3R表達與胰腺癌患者的總體生存率呈負相關，可以為下一步CSF3R與胰腺癌相關分子機制的研究提供參考。