LncRNA CCAT1對結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移的影響及機制

甘兆義，賈秋紅，關航

(貴港市人民醫院，廣西貴港537100)

結腸癌是常見的惡性腫瘤，病因包括遺傳及不良環境因素等[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度超過200 nt的非編碼RNA，主要參與基因轉錄、轉錄后調控和表觀遺傳調控等生物學過程[2]。LncRNA CCAT1位于染色體8q24.21，其序列位于cMyc的一個增強子區2 628 nt[3]。有研究報道，LncRNA CCAT1在多種腫瘤中異常高表達，與腫瘤分期及患者預后相關[4]。但是，目前尚無LncRNA CCAT1與結腸癌關系的相關報道。2016年5月～2017年5月，本研究觀察了LncRNA CCAT1對體外培養結腸癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 結腸癌細胞系SW480及正常結腸上皮細胞系FHC均購自美國ATCC細胞庫。E鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)一抗購自美國BD公司，二抗購自美國Invitrogen公司。LncRNA CCAT1-siRNA及隨機對照序列LncRNA CCAT1-NC均由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養 將結腸癌細胞系SW480及正常結腸上皮細胞系FHC均接種于RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，48 h后消化傳代。

1.3 LncRNA CCAT1表達檢測 采用qRT-PCR法。取對數生長期SW480及FHC細胞，采用qRT-PCR試劑盒檢測LncRNA CCAT1表達。LncRNA CCAT1引物：上游：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′。采用定量2-ΔΔCt法計算 LncRNA CCAT1 相對表達量。結果顯示，結腸癌SW480細胞中LncRNA CCAT1相對表達量為7.26±0.53，高于正常結腸上皮FHC細胞的1.0±0.03(P<0.05)。提示結腸癌細胞中LncRNA CCAT1高表達。

1.4 細胞分組及轉染 將對數生長期的SW480細胞隨機分為CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組和空白對照組，前兩組采用LipofectamineTM2000分別轉染LncRNA CCAT1-siRNA(300 nmol/孔)及隨機對照序列LncRNA CCAT1-NC(300 nmol/孔)，空白對照組常規培養。轉染處理24 h時，采用qRT-PCR法檢測三組LncRNA CCAT1表達，方法參照1.3。

結果顯示，CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組、空白對照組LncRNA CCAT1相對表達量分別為0.27±0.02、1.13±0.04、1.16±0.08，CCAT1-siRNA組低于Control-siRNA組和空白對照組(P均<0.01)，提示轉染LncRNA CCAT1-siRNA可抑制LncRNA CCAT1表達。

1.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染24 h的三組細胞消化制成單細胞懸液，以2×103個/孔種植于96孔板(200 μL/孔)，分別在培養0、24、48、72、96 h時每孔加入CCK-8溶液20 μL，繼續培養1 h，在450 nm波長下，用酶標儀測定各孔光密度(OD)值。

1.6 細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞術。將轉染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細胞消化后給予Binding Buffer重懸，混勻后加入Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin V陽性細胞比例以確定細胞凋亡率。

1.7 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕試驗。將轉染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細胞接種于12孔板，待細胞長至100%融合后，以50 μL Tips槍頭沿培養板中間劃直線，劃線即刻和48 h時分別在顯微鏡下觀察細胞劃痕修復情況。使用WimScratch在線圖像分析系統(德國Wimasis GmbH)測定細胞劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細胞遷移能力越強。

1.8 E-cadherin、MMP-9、Caspase-3表達檢測 采用Western blotting法。將轉染24 h的CCAT1-siRNA組、Control-siRNA組細胞裂解、變性，每孔30 μg蛋白上樣，濃縮膠80 V 50 min，分離膠100 V 100 min，常規轉膜；分別加入E-cadherin、MMP-9、Caspase-3及GAPDH一抗(抗體濃度均為1∶300)，4 ℃孵育過夜；分別加入二抗(1∶500)37 ℃孵育4 h；PBST漂洗3次，在ECL液下顯影，Quantity One 1-D分析目標蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/GAPDH灰度值，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 三組細胞增殖能力比較 轉染24 h結束時再培養48、72、96 h時CCAT1-siRNA組OD450值均低于Control-siRNA組及空白對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組細胞增殖能力比較

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。

2.2 兩組細胞凋亡率比較 CCAT1-siRNA組細胞凋亡率為(14.3±1.5)%，Control-siRNA組為(3.5±0.8)%，組間比較P<0.01。

2.3 兩組細胞劃痕愈合率比較 CCAT1-siRNA組細胞劃痕愈合率為(31.6±2.5)%，Control-siRNA組為(53.4±4.3)%，組間比較P<0.01。

2.4 兩組細胞Caspase-3、E-cadherin、MMP-9表達比較 CCAT1-siRNA組Caspase-3相對表達量高于Control-siRNA組，E-cadherin、MMP-9相對表達量均低于Control-siRNA組(P均<0.01)。見表2。

3 討論

LncRNA對轉錄激活或抑制、染色體修飾與沉默、基因組印記等多個過程都具有調控功能，并在多種疾病包括腫瘤中發揮重要作用[5]。研究發現，在胃癌中LncRNA CCAT1異常高表達與腫瘤分期、淋巴結轉移相關[6]。在乳腺癌中，LncRNA CCAT1高表達與患者的總體生存率密切相關[7]。在肝癌中，LncRNA CCAT1高表達，其表達與腫瘤大小和分期相關，且LncRNA CCAT1是影響肝癌患者預后的獨立影響因子[8,9]。Nissan等[10]發現，結腸癌組織中LncRNA CCAT1表達高于正常腸黏膜組織。LncRNA CCAT1和LncRNA HOTAIR聯用可提高結腸癌的早期診斷率[11]。本研究以結腸癌細胞為研究對象，結果顯示，結腸癌細胞系SW480中LncRNA CCAT1相對表達量高于正常結腸上皮細胞系FHC，提示LncRNA CCAT1高表達與結腸癌的發生相關。

表2 兩組細胞Caspase-3、E-cadherin、MMP-9相對表達量比較

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05。

LncRNA CCAT1位于染色體8q24.21 cMyc基因增強子區域[12,13]。cMyc能夠通過與LncRNA CCAT1啟動子區域的特定區域結合，增強LncRNA CCAT1轉錄，促進癌細胞從G1期進入S期，使細胞獲得無限增殖能力，同時還可抑制細胞凋亡[6]。另外，對膀胱癌的研究發現，LncRNA CCAT1通過競爭性與miRNA-219-5p結合，提高其靶基因Bim1的轉錄與表達水平，促進癌細胞的增殖及侵襲能力；敲除LncRNA CCAT1基因后，癌細胞的增殖能力與侵襲能力均被明顯抑制[14]。本研究我們采用基因轉染的方法抑制結腸癌SW480細胞LncRNA CCAT1表達后發現，細胞增殖、侵襲能力均降低，凋亡增加，提示抑制LncRNA CCAT1表達具有抗結腸癌的作用。

Caspase-3屬于Caspase家族，是重要的細胞凋亡執行蛋白，通常以非活性酶原形式存在，當收到凋亡信號后被激活，進一步阻滯細胞周期，導致染色體聚集、核皺縮、凋亡小體形成等，是反映細胞凋亡水平的一個常用指標[15]。MMP-9和E-cadherin是腫瘤轉移與侵襲過程中重要的標識蛋白。MMP-9屬于MMPs家族，是一類與腫瘤關系十分緊密的蛋白水解酶。MMP-9通過與多種底物結合，包括膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖等，發揮作用[16]。在腫瘤中，MMP-9能夠通過降解胞外基質和基底膜，導致癌細胞突破組織屏障，發生侵襲甚至遠端轉移；還可以通過釋放血管內皮因子，促進血管生成，加速癌細胞增殖[17]。E-cadherin屬于鈣黏素分子家族，其能夠介導細胞間黏附，從而協助細胞傳遞信號、維持細胞形態、細胞間識別和誘導分化等[18]。本研究中，下調LncRNA CCAT1表達的結腸癌細胞Caspase-3表達增加，MMP-9和E-cadherrin表達均顯著降低。

綜上所述，結腸癌細胞中LncRNA CCAT1高表達；下調結腸癌細胞中LncRNA CCAT1表達可抑制細胞增殖、遷移，并誘導凋亡，其機制可能與下調MMP-9、E-cadherrin表達及上調Caspase-3表達有關。提示LncRNA CCAT1在結腸癌中發揮抑癌作用，其有望成為結腸癌治療的潛在分子靶點。