環巴胺對人肺癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響及作用機制

杜建紅，范春水，張虹

(山西藥科職業學院，太原030031)

肺癌細胞中相關基因表達變化參與了細胞生物學行為的調控[1,2]。Hedgehog信號通路是一條高度保守的信號通路，由配體Shh、2個膜受體Patched(Ptch)、G蛋白偶聯受體超家族的7次跨膜蛋白Smo和下游的轉錄因子Gli家族組成，主要參與胚胎發育、組織再生及修復等過程，通過調控細胞生長和存活參與多種腫瘤的發生、發展[3]。環巴胺是近年來常用的抗惡性腫瘤藥物，具有抑制腫瘤細胞生長和增殖的作用，但其作用機制尚未明確。2016年1月～2017年6月我們進行本研究，觀察環巴胺對人肺癌細胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為及其對Hedehog通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞購于美國Abcam公司；CCK-8試劑盒、Matrigel基質膠、Transwell小室購于BD公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 細胞培養 將A549細胞置于含有10% FBS的DMEM-F12培養基中，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，用0.125%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于以下研究。

1.3 環巴胺干預及相關指標觀察

1.3.1 細胞增殖情況 采用CCK-8法。將對數生長期細胞接種于24孔培養板，待細胞融合達80%時，將含10% FBS的DMEM-F12培養基更換為不含血清的DMEM-F12培養基，隨機分為對照組和環巴胺組，環巴胺組加入終濃度為20 μmol/L的環巴胺培養，對照組常規培養。分別在培養0、12、24、36、48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，每組設置3個復孔，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3.2 細胞遷移能力 采用劃痕實驗檢測。取對數生長期細胞，消化后調整細胞密度為2×105個/孔接種于6孔細胞培養板，隨機分為對照組和環巴胺組，兩組處理方法同1.3.1。培養24 h時(T0)采用200 μL無菌移液器槍頭在培養板底部進行“1”字形劃痕，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄；繼續培養12、24、36、48 h，顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄。采用Image J軟件分析數據并計算細胞遷移率。細胞遷移率=(T0時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度)/T0時劃痕寬度×100%。

1.3.3 細胞侵襲能力 采用Transwell侵襲實驗檢測。取對數生長期細胞，消化后調整密度為1×105個/mL加入至小室中，隨機分為對照組和環巴胺組，兩組處理方法同1.3.1。在每個Transwell小室對應的細胞孔內加入60 μL DMEM-F12培養基。分別在培養12、24、36、48 h時取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞和Matrigel膠。固定后沖洗，顯微鏡(200×)下觀察，計數穿膜細胞數。

1.3.4 Hedehog通路相關蛋白Shh、Ptch1、膠質瘤相關癌基因1(Gli1)mRNA表達 采用熒光定量PCR法。取對數生長期細胞隨機分為對照組和環巴胺組，兩組處理方法同1.3.1；收集培養48 h的兩組細胞，提取總RNA后進行逆轉錄得到cDNA，取cDNA進行熒光定量PCR擴增，擴增基因Shh、Ptch1、膠質瘤相關癌基因1(Gli1)[4]。Shh引物：上游：5′-ACCGAGGGCTGGGACGAAGA-3′，下游：5′-ATTTGGCCGCCACCGAGTT-5′；Ptchl引物：上游：5′-CTCCTTTGCGGTGGACAA-3′，下游：5′-CCTCAGCCTTATTCAGCATTTC-3′；Glil引物：上游：5′-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3′，下游：5′-AGCCTCCTGGAGATGTGCAT-3′；內參β-actin引物：上游：5′-CATCCTGGGTCTGGACCTGG-3′，下游：5′-ATTTGGGGTGCACGATGGAGGG-3′。擴增反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 環巴胺組培養12、24、36、48 h時A值均低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞遷移率比較 環巴胺組培養12、24、36、48 h時細胞遷移率均低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞遷移率比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 兩組穿膜細胞數比較 環巴胺組培養12、24、36、48 h時穿膜細胞數均低于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組穿膜細胞數比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.4 兩組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA表達比較 環巴胺組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)。見表4。

表4 兩組Shh、Ptch1、Gli1 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

環巴胺是從山藜蘆中分離得到的一種異甾體類生物堿[5,6]。有研究報道，環巴胺具有抗腫瘤作用，可抑制多種腫瘤細胞的生長、轉移和浸潤，且在胰腺癌、膽管癌、卵巢癌、肝癌等的體內或體外實驗中均得到證實[7～11]。另外，環巴胺與一些抗腫瘤常規化療藥物如5-氟尿嘧啶聯合應用可增加其腫瘤效果[12,13]。但環巴胺不溶于水，也很難溶解在有機或者無機溶劑中，限制了其在臨床的應用。目前關于環巴胺與肺癌發生發展的關系鮮見報道。肺癌細胞發生浸潤、轉移與機體多種基因表達異常密切相關，篩選影響肺癌轉移和復發的基因有助于肺癌的靶向治療，亦有利于對肺癌患者進行風險分級管理[6]。本研究結果顯示，環巴胺可抑制肺癌細胞增殖、遷移及侵襲，提示環巴胺可抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。

Alam等[14]報道，環巴胺酒石酸鹽可通過促進線粒體分裂和分化、促進線粒體膜超極化以及產生活性氧等機制，減弱線粒體呼吸，進而抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，但其具體作用機制尚未闡明。Hedgehog信號通路中Ptch能夠與Smo結合而使Smo喪失活性，從而抑制Hedgehog通路的傳導[15]。當Hedgehog信號通路激活時，Hedgehog與Ptch結合，其對Smo的抑制作用被解除而激活，進一步激活Hedgehog信號通路最下游的轉錄因子Gli，最終調控組織細胞靶基因的特異性表達[16]。Hedgehog基因突變失活可誘發多種先天畸形和惡性腫瘤[17,18]。研究提示，Hedgehog信號通路中Hedgehog基因突變可誘發胃癌、肺癌等多種腫瘤。陳晶等[4]研究顯示，乳腺癌組織Shh mRNA相對表達量遠高于癌旁組織，Shh基因異常表達可能與乳腺癌的發生有關；非復發乳腺癌組織中Shh mRNA相對表達量遠低于復發組織，提示Shh與乳腺癌患者術后腫瘤復發關系密切。邵力偉等[19]研究發現，Shh、Ptch1及Gli1在乳腺癌組織中均呈高表達，不同濃度環巴胺均可抑制乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡。胰腺癌組織中Ptch1 mRNA與蛋白相對表達量均明顯高于癌旁組織，并且與胰腺癌的分化程度和TNM分期明顯相關。

Hedgehog信號通路與肺癌關系的研究目前相對較少，并且存在一些爭議。Yuan等[20]研究顯示，不同亞型的非小細胞肺癌細胞系通過自分泌途徑可激活Hedgehog通路和其下游轉錄因子Gli1；如果將細胞中Gli1基因敲除，上述細胞系表現為對Hedgehog信號通路抑制劑敏感。非小細胞肺癌組織標本中所有Hedgehog信號分子均高表達，在肺鱗癌中Path1和Smo明顯高表達[21]。Chi等[22]報道，84.2%的非小細胞肺癌組織中Shh陽性表達，僅10.5%有Ptch/Gli 陽性表達。Vestergaard等[23]研究顯示，85%的小細胞肺癌患者的肺癌組織中存在Gli表達；而20株體外培養的不同小細胞肺癌細胞系中僅有1株細胞檢測到Gli1陽性表達，2株細胞Shh陽性表達。Watkins等[24]認為，小細胞肺癌細胞中Hedgehog信號通路持續激活，相關產物均高表達。本研究結果顯示，環巴胺抑制Hedgehog信號通路Shh、Ptch1、Gli1表達，提示環巴胺可抑制肺癌細胞Hedgehog信號通路上各蛋白表達，從而抑制Hedgehog信號通路的生物學作用，環巴胺對肺癌細胞惡性生物學行為的抑制作用的生物學靶點可能是Hedgehog信號通路。

綜上所述，環巴胺抑制肺癌細胞增殖、侵襲及遷移，抑制Hedgehog信號通路可能是其作用機制。Hedgehog信號通路相關蛋白Shh、Ptch1、Gli1可能成為肺癌治療的靶點。