二甲雙胍聯合順鉑對孕激素耐藥子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、凋亡的影響及機制

馮文,孫敏,張吉瑞,楊成喜

(徐州醫科大學附屬連云港第一人民醫院，江蘇連云港 222000)

子宮內膜癌多好發于圍絕經期及絕經后女性，病死率高。目前臨床仍以手術治療為主，對于晚期、復發及有意愿保留生育功能的部分患者，放化療、激素治療是較佳選擇[1,2]。大劑量孕激素治療雖對孕激素受體陽性、子宮內膜不典型增生者療效頗佳，有效率可達70%。但其禁忌證較多，應用受限，對孕激素耐藥患者效果不佳[3]。單獨放療、化療較少用于子宮內膜癌的治療，多以術后輔助放療聯合化療的形式用于臨床。一線所用化療藥物主要是順鉑，有較好的劑量反應效應，增加劑量可使療效增高，但在達到預期治療效果的同時毒性作用亦隨之增大[4]。林瓊燕等[5]研究顯示，順鉑的作用效應可能與mTOR信號通路有關。mTOR 信號通路被證實參與多種腫瘤細胞的增殖凋亡過程。王夢瑩等[6]研究發現，二甲雙胍具有激活AMPK信號通路，抑制mTOR活化(磷酸化)，進而抑制耐孕激素子宮內膜癌細胞增殖的潛在價值。順鉑及二甲雙胍可能存在藥物的增強作用，但是否能協同治療內宮內膜癌鮮見報道。2013年1月～2014年12月，我們觀察了二甲雙胍聯合順鉑對孕激素耐藥子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 高分化孕激素耐藥的子宮內膜癌Ishikawa細胞(ERα、β、PR均呈陽性)由北京大學人民醫院惠贈。注射用順鉑(批號：20140372)，規格：10 mg×5支，購自齊魯制藥有限公司；二甲雙胍(批號：20120056)、甲羥孕酮(批號：23020715)購自美國Simga公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；小牛血清、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購自美國Hyclone 公司；二甲基亞砜DMSO(批號：2017/05/09)購自上海滬崢生物科技有限公司；TRIzol試劑、熒光PCR分析試劑盒及細胞裂解液均購于上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；兔抗人AMPK多克隆抗體、p-AMPK(磷酸化位點-蘇氨酸172)多克隆抗體、p-mTOR多克隆抗體(磷酸化位點-絲氨酸2448)及mTOR單克隆抗體、GAPDH一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗羊二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；ELX800全自動酶標儀(美國Bio Tek公司)、Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)、LightCycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR系統(美國RCHO公司)、全自動凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

1.2 細胞培養 將Ishikawa細胞常規接種含10%優質小牛血清及雙抗(100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)的RPMI1640高糖培養基中無菌培養，保持孵箱37 ℃恒溫，調節CO2濃度至5%，相對濕度為90%。觀察細胞狀態，單層貼壁生長，每2 d換液1次，細胞融合度達80%時，棄培養基，PBS洗凈，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化傳代，取對數期細胞進行后續實驗。

1.3 孕激素耐藥的子宮內膜癌細胞系構建 甲羥孕酮用DMSO溶解制成濃度為15 μmol/L的母液，后稀釋為實驗所需濃度。取上述對數期細胞，換用含甲羥孕酮的培養基繼續培養，調節甲羥孕酮濃度為1 μmol/L 的起始含量，持續誘導Ishikawa細胞。每隔2 d更換培養液，當細胞80%左右融合時消化傳代并誘導，4代后采用高濃度甲羥孕酮培養基，按照2.5、5、7.5、10、15 μmol/L的規格每周增加藥物濃度。若被誘導的Ishikawa細胞能在最大濃度15 μmol/L的甲羥孕酮培養基中的增殖速率對等其在普通培養基中的增殖速率時可認為耐藥成功。

1.4 細胞抑制率測算 采用MTT法。取處于耐藥成功的Ishikawa細胞，反復吹打成調整密度制成單細胞懸液(1×105/mL)，接種于96孔板中，各孔約100 μL，貼壁厚無血清24 h培養，加入各組藥物(均為100 μL)。各組處理如下：二甲雙胍組：加入稀釋后的不同濃度的二甲雙胍(終濃度為1、2.5、5、10、15 mmol/L)；順鉑組：加入濃度為5、12.5、25、50、75 μmol/L的順鉑；聯合用藥組：為使藥物濃度一致，二甲雙胍聯合順鉑以各自相應的終濃度按1∶200進行給藥；對照組：未添加任何藥物的無血清培養液處理的細胞；空白組：無藥物及細胞的培養液。每組設 4個平行孔，加藥后各組繼續培養48 h ，更換培養液同時終止反應。反應終止后每孔加入20 μL的 MTT 5 g/L，于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續培育4 h，排槍小心吸去上清，加入150 μL DMSO，避光條件下用振蕩器搖勻10 min，溶解紫色結晶。放置酶標儀在490 nm波長處測量各孔吸光度(A)值，計算細胞抑制率，細胞抑制率%=[1-(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%，實驗重復3次，計算二甲雙胍與順鉑的半數抑制濃度(IC50)。根據計算的IC50，后續研究中用10 mmol/L二甲雙胍(二甲雙胍組)、60 μmol/L順鉑(順鉑組)、10 mmol/L二甲雙胍+60 μmol/L順鉑(聯合用藥組)處理細胞48 h。

1.5 藥物聯合作用評價 根據各組計算的IC50，運用CompuSyn軟件計算二甲雙胍與順鉑聯合用藥的聯合指數(CI)，當 CI<1時提示兩藥有協同作用；CI=1時提示兩藥作用性質為相加效應 ；CI>1則提示兩藥存在拮抗效應。

1.6 細胞凋亡率測算 收集耐藥后的Ishikawa細胞，以2×105/mL接種于6孔板中，待細胞貼壁生長后以無血清的RPMI1640培養基培養24 h，二甲雙胍組、順鉑組、聯合用藥組分別添加等量10 mmol/L二甲雙胍、60 μmol/L順鉑，10 mmol/L二甲雙胍+60 μmol/L順鉑，以不施加任何藥物的完全培養基為對照組。培養48 h后用胰酶消化細胞，加入NB血清終止，用預冷的PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入400 μL結合緩沖液重懸細胞并計數。將細胞懸液置于流式管中，先后加入500 μL Binding Buffer溶液、5 μL FITC標記的Annexin V混合液和5 μL Propidium Iodide溶液，小心混勻，避光孵育30 min，隨即加入400 μL結合緩沖液，1 h內采用流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次，每個樣本檢測1×105～5×105個細胞。

1.7 各組細胞mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。將耐藥成功的腫瘤細胞接種于常規培養皿中，24 h培養后，二甲雙胍組、順鉑組、聯合用藥組分別用10 mmol/L二甲雙胍、60 μmol/L順鉑、10 mmol/L二甲雙胍聯合60 μmol/L順鉑處理細胞72 h。TRIzol試劑裂解細胞提取RNA，紫外分光光度計分析總RNA，按試劑盒說明書每組取等量RNA逆轉錄合成cDNA,進行PCR反應，以GAPDH為內參，Bcl-2、Bax反應條件：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s (40 個循環)；72 ℃ 10 min。用全自動凝膠圖像分析系統采集圖像并記錄電泳結果，以目的基因條帶/GAPDH條帶值表示基因的相對表達，實驗重復4次。本實驗中，內參基因及目的基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計，Bcl-2正向引物為5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3′，反向引物為5′-GCATCCCAGCCTCCGTTATC-3′，引物大小為304 bp；Bax 正向引物5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′，反向引物5′- GGCGGCAATCATCCTCTG -3′，引物大小為257 bp。

1.8 各組細胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取上述三組細胞于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，8 h后取出。PBS沖洗細胞2次，100 μL RIPA細胞裂解液提取總蛋白，振蕩混勻，BCA法測定蛋白濃度。12 000 r/min 離心，各組取等量蛋白溶液加樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離目的蛋白質，將分離后的蛋白質以恒壓120 V濕轉膜，室溫下用含50 g/L脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入稀釋(1∶1 000)后的p-AMPK、AMPK、mTOR、GAPDH一抗和稀釋(1∶200)后的p-mTOR一抗，4 ℃搖床過夜；次日漂洗后加入稀釋(1∶2 000)后的IgG二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS再次洗膜后ECL暗室顯影。應用Image J軟件，以目的基因蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH內參蛋白灰度值比值表示其相對表達水平的高低，操作重復 3 次。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 培養48 h后，經方差分析提示，二甲雙胍在2.5～15 mmol/L(F=8.481，P=0.000)、順鉑在12.5～70 μmol/L(F=12.467，P=0.000)濃度內孕激素耐藥的Ishikawa細胞增殖受到抑制，且具有劑量依賴性效應，二者抑制作用隨藥物濃度的增高而逐漸增大，差異有統計學意義(P均<0.05)。二甲雙胍的IC50為(10.44±0.57)mmol/L、順鉑為(60.22±0.78)μmol/L。二甲雙胍在終濃度為10、15 mmol/L時聯合順鉑(對應終濃度為50、75 μmol/L)對腫瘤細胞的抑制程度高于二者單用，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05；與對照組相比，cP<0.05。

圖1 MTT法檢測二甲雙胍及順鉑對腫瘤細胞增殖的影響

2.2 藥物聯合效應評價 各濃度二甲雙胍聯合對應濃度的順鉑均具有協同作用，在順鉑20 μmol/L聯合二甲雙胍5 mmol/L左右，呈現明顯協同效應。見表1。

表1 不同濃度二甲雙胍聯合順鉑的聯合指數

2.3 各組細胞凋亡率比較 對照組、二甲雙胍組、順鉑組、聯合用藥組的細胞凋亡率分別為2.46%±0.34%、19.51%±2.07%、26.14%±2.53%、37.19%±3.08%，4組間比較差異有統計學意義(F=6.421，P=0.000)。同對照組相比，二甲雙胍組(q=5.372，P<0.05)、順鉑組(q=4.149，P<0.05)、聯合用藥組(q=10.068，P<0.05)的凋亡率均增高。近一步分析，聯合用藥組對比順鉑組及二甲雙胍組，細胞凋亡率分別上升了11.17%±1.87%、17.63%±1.28%，差異有統計學意義(q順鉑=7.015，q二甲雙胍=14.233；P<0.05)。

2.4 三組目的基因相對表達量比較 三組Bcl-2的相對表達量差異有統計學意義(F=3.742，P=0.035)。其中，聯合用藥組 Bcl-2相對表達量最低，其次為順鉑組(P<0.05)；聯合用藥組Bax/Bcl-2水平高于順鉑組及二甲雙胍組(P均<0.05)；而三組Bax mRNA的相對表達量比較，P均>0.05，見圖2。

2.5 三組相關蛋白表達量比較 三組p-AMPK、p-mTOR蛋白相對表達量差異有統計學意義(F=4.326，P=0.007)；聯合用藥組p-AMPK蛋白表達較二甲雙胍組、順鉑組高(P<0.05)，而p-mTOR蛋白表達則低(P<0.05)。

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05。

圖2 各組目的基因相對表達含量的檢測結果分析

順鉑組p-AMPK蛋白表達高于、p-mTOR低于二甲雙胍組(P均<0.05)。AMPK、mTOR總蛋白水平變化不明顯，三組差異無統計學意義(P均>0.05)，見圖3、圖4。

圖3 三組蛋白印記檢測結果分析

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05。

圖4 三組相關蛋白表達分析

3 討論

保守治療更適于年輕化且有生育需求的子宮內膜癌患者，通過孕激素拮抗雌激素固然是臨床較佳選擇。然而，近年流行病學數據及細胞體外培養實驗提示，大量、長期使用孕激素可使子宮內膜癌細胞對其敏感性下降，形成耐藥[7]。常用化療藥物順鉑由于其能破壞DNA正常表達，具有較強的細胞毒性，通常以聯合用藥方式減輕其劑量，但就目前現有化療藥物組合來看，治療效果難達預期，新的聯合方案則多從協同順鉑作用通路著手。現代醫學發現，二甲雙胍除能抑制糖異生、促進脂肪酸氧化外，亦具有激動AMPK，抑制腫瘤細胞增殖的能力。二甲雙胍聯合順鉑在治療黑色素瘤方面已初見成效，同時，王小慧等[8]研究中證實單用二甲雙胍可改善子宮內膜癌惡性增殖情況，其用藥安全，不良反應小，聯合順鉑治療孕激素耐藥的子宮內膜癌有望成為臨床新的輔助治療方案。

二甲雙胍可通過直接及間接的方式影響腫瘤細胞代謝，間接作用依賴于p-AMPK(AMPK活化形式)的生成，抑制糖異生相關基因的轉錄及骨骼肌對葡萄糖的攝取能力，此機制可減少胰島素對腫瘤細胞有絲分裂的促進作用，與多種腫瘤細胞的增殖過程相關，此在牛藝潔等[9]的研究中有所闡述。直接作用則是通過增加p-AMPK負調控其下游物質-mTOR的磷酸化(活化形式)。磷酸化的mTOR參與多種生長因子整合過程，亦是PI3K/Art信號通路中重要的調控分子，與腫瘤細胞的增殖凋亡息息相關。本研究中，二甲雙胍在2.5～15 mmol/L濃度范圍內明顯抑制了細胞增殖，且該抑制作用隨濃度增加而增加，濃度過低未能達到藥物有效濃度，濃度高于15 mmol/L的效應仍需進一步討論。早期細胞實驗顯示，雷帕霉素聯合順鉑治療肺癌細胞具有明顯協同作用，因雷帕霉素為mTOR抑制劑，可下調mTOR信號通路下游分子，增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性[10]。本研究MTT結果顯示，二甲雙胍終濃度為10、15 mmol/L時聯合順鉑(對應終濃度為50、75 μmol/L)能明顯抑制腫瘤細胞的增殖，高于二者單用，同時聯合指數提示二甲雙胍聯合順鉑對Ishikawa細胞的生長抑制具有協同作用。二甲雙胍能降低p-mTOR的表達，減弱其下游分子p70S6K對AKt的負反饋抑制，降低癌細胞對順鉑的耐藥程度，增強其細胞毒性，這可能是二者具有協同作用的原因，與Soyama等[11]研究結論相似。

Bcl-2是細胞凋亡中關鍵的癌基因之一，能抑制凋亡，其基因家族中的Bax基因則是一種極為重要的促凋亡基因，過度表達可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用。在正常情況下Bax與Bcl-2間保持一定比例，二者間的動態平衡調節促凋亡因子Caspase-3表達，決定了細胞的存亡[12]。本研究結果顯示，聯合用藥組對比二甲雙胍組及順鉑組可明顯下調Bcl-2蛋白表達，而Bax并未發生明顯變化，二者比值隨Bcl-2基因表達產物的降低而增大，此提示二甲雙胍聯合順鉑可促進孕激素耐藥子宮內膜癌細胞凋亡的發生。Bcl-2是Akt信號通路的下游分子，當p-Akt因p-mTOR受抑制而減少時，磷酸化Bad隨即下調，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，促進腫瘤細胞凋亡。更值得關注的是，Bcl-2表達與腫瘤耐藥存在正向關系，聯合用藥組Bcl-2表達降低提示細胞對藥物的敏感性可能有所提升[13]。本研究PCR實驗結果同流式細胞儀檢測結果一致，聯合用藥組的凋亡率高于二甲雙胍組、順鉑組，差異有統計學意義，提示二甲雙胍聯合順鉑具有促進孕激素耐藥Ishikawa細胞凋亡的潛力。Western blotting結果提示，二甲雙胍聯合順鉑可抑制腫瘤增殖、促進凋亡，機制可能與AMPK/mTOR通路有關，AMPK活化增高，mTOR活化降低，但二者總蛋白AMPK及mTOR含量未見明顯變化。說明二甲雙胍聯合順鉑對細胞通路的作用可能集中于目的基因翻譯修飾后[14]，未曾改變基因本身的表達，對細胞正常活動影響較小。

綜上所述，二甲雙胍聯合順鉑對孕激素耐藥的子宮內膜癌細胞有協同作用，可抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，該作用機制可能與AMPK/mTOR通路相關。