BIM基因多態(tài)性對HBV感染相關(guān)性肝癌臨床結(jié)局的影響

宋孝美，李青嶺，郭進軍

(1重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3重慶市急救醫(yī)療中心)

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一[1,2]，肝癌的發(fā)生是多因素、多基因、多步驟、環(huán)境和遺傳因素共同作用的復(fù)雜過程,既往有研究表明個體遺傳變異對疾病發(fā)生及預(yù)后有重要影響[3]。宿主基因多態(tài)性是決定個體遺傳變異的重要方面。但目前尚無具體共識來闡釋宿主基因多態(tài)性對肝癌臨床結(jié)局的影響，大部分研究仍是小樣本的橫斷面研究，缺乏長期動態(tài)隨訪觀察來闡明宿主多態(tài)性與肝癌臨床結(jié)局影響的相關(guān)性。BIM是Bcl-2家族的成員之一，具有凋亡活性，在自身免疫、維持造血穩(wěn)態(tài)及腫瘤抑制方面均有作用。既往研究表明，BIM基因多態(tài)性在白血病、非小細胞肺癌、乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有重要作用[4～6]。通過抑制BIM基因的表達將會影響腫瘤進展及代謝。尚無研究BIM基因多態(tài)性與肝癌患者生存預(yù)后的影響。因此，我們探討B(tài)IM基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝癌患者的生存期及臨床結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月～2013年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診斷HBV感染相關(guān)性肝癌患者200例，納入標準：①肝癌的診斷根據(jù)臨床癥狀及生化指標診斷，且得到影像學(xué)CT或MRI證據(jù)或病理組織學(xué)檢查結(jié)果；②治療方法僅經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)或支持治療的患者。排除標準：①其他部位腫瘤轉(zhuǎn)移到肝癌的患者；②合并人類免疫缺陷病毒或其他肝炎病毒(HAV、HCV、HDV和HEV)及其他非嗜肝病毒感染所致的肝病；③其他慢性肝病患者：如原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝病、酒精性肝病、藥物性肝炎等；④嚴重心腎疾病及其他系統(tǒng)腫瘤患者。通過門診、住院和電話相結(jié)合的方法進行隨訪，隨訪至2016年12月31日，從患者首次住院到死亡日或最一后次隨訪時間為患者生存期限，以月為計量單位。對于隨訪截止日仍存活的患者作為截尾值處理。排除生存時間小于1個月的患者，最終共納入患者176例，男160例、女16例，年齡(52.67±12.13)歲。ALT 4.00～785.00 IU/L，AST 16.00～736.00 IU/L，TBIL 6.70～395.00 μmol/L，ALB 9.60～49.50 g/L，ALP 55.00～1 087.00 IU/L，GGT 9.00～1 296.00 IU/L，基線AFP<200 ng/mL者92例，≥200 ng/mL者84例，Child-Pugh 分級A級100例，B級50例，C級26例，腫瘤直徑< 5 cm者108例，≥ 5 cm者68例，肝硬化140例，腫瘤數(shù)量單發(fā)134例，多發(fā)42例，抗病毒治療112例，腫瘤復(fù)發(fā)42例，腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移42例，多發(fā)轉(zhuǎn)移52例，癌栓82例，HBV-DNA>104IU/L 60例。其中TACE患者106例(TACE組)，僅對癥支持治療患者70例(對照組)。中位生存時間1.0～70.0個月，平均19.7個月。本研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 研究方法 篩選候選基因，本課題組前期已經(jīng)篩選出BIM基因的rs1877330、rs3761705、rs3761706、rs3789068、rs6727356、rs6746608、rs724710、rs3827537。對以上SNPs作哈溫平衡檢測，符合哈溫平衡的rs1877330、rs3761706、rs3789068、rs6746608、rs724710、rs3827537作為對肝癌生存分析的候選基因。對入組的患者臨床資料建立檔案，通過門診、住院和電話相結(jié)合的方法進行隨訪，詳細詢問患者出院后的后續(xù)治療及臨床結(jié)局，隨訪指標包括肝功能、兩對半肝生化指標、HBV-DNA、甲胎蛋白、肝纖譜情況、影像學(xué)、抗病毒治療情況、TACE治療情況及臨床結(jié)局。評價指標包括腫瘤大小、數(shù)量、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況、門靜脈癌栓情況、AFP變化趨勢及肝功能情況。記錄生存狀態(tài)及生存時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。以患者首次住院至死亡日或至最后一次隨訪時間為患者生存期限，生存時間用中位數(shù)(范圍)表示。年齡、性別、AST、ALT、GGT、ALP、白蛋白、膽紅素、HBV-DNA的載量、基線AFP、腫瘤大小、數(shù)量、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況、抗病毒情況、門靜脈癌栓情況、TACE情況,AFP變化趨勢及肝功能分級作為影響患者生存時間的候選因素，分別采用Kaplan-Meier 曲線及Log-Rank檢驗比較其生存差異，對有意義的單因素或臨床認為有意義的單因素作COX回歸多因素分析，分析每項因素的相對危險度及95%可信區(qū)間；用MDR分析SNP間的相互作用。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 176例HBV感染相關(guān)肝癌患者預(yù)后總生存期分析 單因素分析結(jié)果顯示，rs761706 CC基因型較TC+TT基因型生存時間更長(P=0.016, 圖1), rs724710 CT+TT基因型較CC基因型生存時間更長(P=0.008)。年齡越小(P=0.001)，基線ALT、AST水平越低(P分別為0.006、0.001)，ALB 越高(P=0.003)，HBV-DNA載量越低(P=0.021)，基線AFP越低(P<0.001)，Child-Pugh分級越低(P=0.01),抗病毒治療(P<0.001)患者生存時間越長；腫瘤學(xué)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑越小(P<0.001),無癌栓(P<0.01),無轉(zhuǎn)移(P<0.001)，治療后AFP呈降低趨勢，患者生存時間越長。多因素分析結(jié)果顯示，rs761706 CC基因型是延長患者生存時間的獨立因素(HR=3.913,95%CI1.150～13.315,P=0.016)，基線AFP越低(HR= 4.966,95%CI2.429～10.154,P=0.001),AST水平越低(HR=8.659,95%CI2.52～29.749,P=0.001),TB水平越低 (HR=3.203,95%CI1.325～7.746,P=0.01)，ALB水平越高(HR=2.874,95%CI1.298～6.363,P=0.009)，腫瘤越小(HR=3.881,95%CI1.690～8.912,P=0.01)，無癌栓(HR=13.715,95%CI2.335～80.565,P=0.04)患者生存時間越長。

圖1 rs3761706、rs724710不同基因型HBV相關(guān)感染肝癌患者的生存曲線

2.2 TACE組患者生存期分析 TACE組患者中位生存時間1～71個月，平均26.1個月。截止到2016年12月31日，78例患者死亡(占73.6%)，其中男72例、女6例。單因素生存分析結(jié)果顯示，rs761706 CC基因型較TC+TT基因型生存時間更長(P=0.043,圖2)；rs724710 CT+TT基因型較CC基因型生存時間更長(P=0.003,圖2)；rs3827537 TA+AA基因型較TT基因型生存時間更長(P=0.003,圖2)，且基線AFP越低(P=0.001)，行抗病毒治療(P=0.003)患者生存時間越長。腫瘤學(xué)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，無門靜脈癌栓(P=0.013)、腫瘤直徑越小(P<0.001)，無轉(zhuǎn)移(P=0.001),術(shù)后AFP降低(P=0.008)，患者生存時間越長。多因素分析結(jié)果顯示，基線AFP (HR=16.507，95%CI3.504～89.213，P=0.001)，術(shù)后AFP變化趨勢(HR=0.009，95%CI0.000～0.547，P=0.025)，腫瘤大小(HR=17.656，95%CI:5.248～59.406，P<0.001),ALB水平(HR=6.667，95%CI2.038～21.809，P=0.002)，TB水平(HR=10.473，95%CI1.063～103.109，P=0.044), 癌栓(HR=0.000，95%CI0.000～0.019，P=0.031)，rs3827537 T/A(HR=18.654，95%CI2.082～167.164，P=0.009)是影響患者生存率的獨立危險因素。

2.3 對照組患者生存期分析 截止到2016年12月31日，對照組68例患者死亡(占97.1%)，其中男60例、女8例，中位生存時間1～49個月，平均10個月。單因素分析結(jié)果顯示，rs761706 CC基因型較TC+TT基因型生存時間生存時間更長(P<0.001)，且年齡越小(P<0.001)、基線AFP水平越低(P=0.002)，ALT、AST、ALP、GGT、TB水平越低(P<0.001)，ALB水平越高(P<0.001)，患者生存時間越長。在腫瘤學(xué)的相關(guān)性分析中表明，無門靜脈癌栓(P=0.001)、腫瘤直徑越小(P=0.048)、無轉(zhuǎn)移(P=0.002),患者生存時間越長。多因素分析結(jié)果顯示，以上因素并非患者生存時間的獨立危險因素。

圖2 HBV相關(guān)感染的肝癌生存時間與rs3761706 C/C(T)、rs724710C/C(T)及rs3827537 T/A(T)關(guān)系的生存曲線

2.4 SNP之間的相互作用 由于rs3761706、rs724710、rs3827537在TACE組與對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們用MDR軟件分析這三個SNP間的相互作用。發(fā)現(xiàn)三種重要的模型：①rs3827537；②rs724710-rs3827537；③rs3761706-rs724710-rs3827537。經(jīng)過比較，最佳模型：rs3761706-rs724710-rs3827537(TBA=0.6147，CVC：10/10，P：0.012～0.013)。見表1。

表1 3種SNP間的相互作用比較

注：①檢驗平衡準確性；②交叉驗證一致性；③1 000次置換檢驗計算后的P。

3 討論

原發(fā)性肝癌是目前我國第三位的腫瘤致死病因[1]。肝癌發(fā)生是病毒、免疫和宿主基因之間的共同作用[7]。而宿主基因組多態(tài)性被認為是肝癌臨床結(jié)局的關(guān)鍵因素，既往研究表明，某些宿主基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生相關(guān)[8～10]。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)BIM rs3761706 CC等位基因，rs724710基因型CT+TT及rs3827537基因型TA+AA與延長肝癌患者生存時間有關(guān)。不同治療方式的患者中，rs3761706基因多態(tài)性均是影響患者生存時間的危險因素。TACE組行單因素分析發(fā)現(xiàn)，rs724710 CT+TT基因型及rs3827537 TA+AA基因型與延長患者生存時間密切相關(guān)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，rs3827537 TA+AA基因型是延長患者生存時間的獨立因素。由于對照組患者數(shù)量相對較少，尚未在對癥支持治療中發(fā)現(xiàn)rs724710及rs3827537 基因多態(tài)性與患者生存時間的關(guān)系。對SNP進行MDR分析時，即使在1 000次置換檢驗之后，我們?nèi)园l(fā)現(xiàn)3個SNP(rs3761706、rs724710、rs3827537)相互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見BIM基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝癌患者生存期有關(guān)，提示BIM基因多態(tài)性可作為肝癌患者的預(yù)后指標。這與既往研究提示BIM在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用結(jié)果一致[11]。

BIM基因是Bcl-2家族的促凋亡基因成員之一，被認為是T細胞的抑制基因，在防止自身免疫、炎癥及腫瘤的發(fā)生中有重要作用[12]。BIM基因主要通過Bax,使線粒體釋放細胞色素C，并且激活胱氨酸蛋白酶，最終導(dǎo)致細胞死亡[13]。BIM基因的表達在HBV相關(guān)感染肝癌患者中可調(diào)控細胞凋亡。而誘導(dǎo)細胞凋亡是腫瘤治療的重要措施，因此可應(yīng)用有效刺激誘導(dǎo)腫瘤細胞中BIM基因多態(tài)性表達上調(diào)。

TACE是一種介入治療中晚期原發(fā)性肝癌患者的主要治療方式。相比對癥支持治療，可有效延緩肝癌進展的速度，從而延長患者生存時間，是目前公認的中晚期患者首選治療方法。TACE主要通過栓塞腫瘤供血的動脈，阻斷腫瘤的血供，從而達到抑制腫瘤生長、促使腫瘤細胞壞死、凋亡的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，TACE患者相對于對癥支持治療患者生存時間明顯延長，且患者TACE次數(shù)越多，患者總生存期越長，該結(jié)果與既往Giannini等[14]的研究一致。本研究對比了106例TACE組患者及70例對照組患者的平均生存期、中位生存期及1年、3年、5年生存率，TACE組中位生存期及平均生存期明顯長于對照組，而在1年、3年、5年生存率方面，TACE組亦較對照組有優(yōu)勢。在肝功能分級方面，肝功能分級與患者總生存期相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在亞組分析中尚未發(fā)現(xiàn)TACE及對照組患者中肝功能分級對總體生存率的影響，可能是由于樣本數(shù)量相對較少導(dǎo)致。在TACE患者中,我們發(fā)現(xiàn)腫瘤的大小、基線AFP、ALB水平及TB水平是影響患者生存時間的獨立危險因素。而在對照組中，尚未發(fā)現(xiàn)影響總生存率的獨立危險因素，可能由于樣本量太少所致。

綜上所述，BIM rs3761706等位基因CC、rs724710基因型CA及rs3827537基因型TA有助于延長HBV感染相關(guān)肝癌患者總體生存率。同時本研究亦證實了TACE是肝癌患者的有效治療方法，能明顯延緩患者生存時間，且在TACE患者中，rs3827537 T/A作為影響患者生存期的獨立因素，對于判斷TACE患者的預(yù)后有指導(dǎo)意義。