酶解核桃蛋白制備降血壓肽的工藝優化

裴璞花，安傳相，劉曉燕，馬立志，*，陳鴻申

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005；3.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005；4.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

高血壓是指在靜息狀態下或未服用降壓藥物，動脈收縮壓或舒張壓升高為特征的“心血管綜合癥”，被世界公認為是人類健康“無形殺手”，近些年來，隨著經濟的飛速增長發病率也在逐年遞增且呈現年輕化[1-2]。高血壓易引起患者中風及心腦、腎等器官的損害[3]。因此對高血壓的預防和治療，是全球人民勢在必行的任務[4-5]。

降血壓肽又稱血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制肽。血管緊張素轉化酶是一種含鋅元素的二肽-羧肽酶，又叫作羧基二肽酶，在調節血壓中發揮著至關重要的作用[6]。它一般是利用蛋白酶水解而獲得的，對高血壓患者具有獨特的降壓效果，而對血壓正常的人群無降壓作用，因此不會出現降壓過度的現象，安全性是極高的[7]。

眾所周知，核桃蛋白是一種極為優質的蛋白。其含有18種氨基酸，并且包括了人體所必需的8種氨基酸，且谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、組氨酸等含量相對較高[8-9]。近幾年研究發現，人體攝取蛋白質經消化作用后，是以小分子肽的形式吸收，而不是主要以氨基酸分子形式吸收[10]。另外，有些肽不僅能夠提供人體生長和發育所需的營養物質，同時還兼具降低血壓的作用。但是，目前我國大部分地區核桃粕被作為飼料和肥料使用，產生極大的浪費[11]。本研究是以壓榨去油后的核桃粕為原料，用堿性蛋白酶酶解，采用響應面法優化最佳酶解條件，得到優質的核桃降血壓肽。同時也期望為核桃蛋白的深加工以及大規模生產提供有效的基礎數據及研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

核桃蛋白：貴陽學院食品與制藥工程學院食品分析與研究實驗室制備。堿性蛋白酶（20×104U/g）：Ruiaibio公司；血管緊張素轉換酶（ACE）：美國Sigma公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Malonyl-histidylleucine，HHL）：美國Sigma公司；四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine，TEMED）：Ruiaibio公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris aminomethane）：天津市科密歐化學試劑有限公司；甘氨酸（Glycine）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecylsulfate）、巰基乙醇、甘油（Glycerol）、溴酚藍（Bromophenol）、丙烯酰胺（Acrylamide）、過硫酸胺：Ruiaibio公司。

1.1.2 儀器

FA2104萬分之一電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；PHB-4雷磁牌數字型PH計：上海精科雷磁公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；DL-5-B飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠；FD-1B-50真空冷凍干燥機：南京杰全微波設備有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計：日本島津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃降壓肽的制備

稱取適量的核桃蛋白配制成一定濃度的核桃蛋白溶液，依照酶解條件進行試驗。在酶解的過程中連續滴加0.5mol/L的NaOH溶液，維持pH值穩定。酶解2 h后，在 90℃水浴中滅酶 10 min，離心（4 000 r/min）20 min后，將沉淀棄去，保留上清酶解液并旋轉蒸發濃縮后，進行真空冷凍干燥，即可得到核桃降壓肽。

1.2.2 ACE抑制率體外檢測方法[12]

按表1操作后，經漩渦混合器振蕩15 s混勻后進行離心（4 000 r/min）20 min后，用移液吸嘴移取1.0 mL乙酸乙酯放置于試管中，在120℃的恒溫干燥箱中烘干，再將3 mL的去離子水中添加至烘干的試管中，使其充分溶解后在波長228 nm處測定其吸光度，計算公式為：

式中：A樣品為反應中酶解液和ACE同時存在的吸光度；A對照為反應中未加樣品液的吸光度，即對照；A空白為ACE和HHL空白反應的吸光度，即空白。

1.2.3 單因素試驗

選擇不同酶解溫度、pH值、加酶量及底物濃度進行單因素試驗，探究各因素對核桃降壓肽ACE抑制率的影響。

1.2.4 響應面法分析

運用Design-Expert8.0軟件程序中的 Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取酶解溫度、pH值、加酶量、底物濃度進行四因素三水平試驗，對核桃降壓肽的制備工藝進行優化。在單因素試驗的結果上，自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼（見表2），共設計29個試驗點，以ACE抑制率為響應值，設計響應面分析試驗。

表1 ACE抑制率體外檢測方法Table1 Composition ofreaction system for determining ACE inhibition ratio

表2 因素水平編碼表Table2 Factors and levels

表3 凝膠配制表Table3 Gel preparation table mL

1.2.5 驗證性試驗

在響應面優化的試驗條件下，進行3次平行的驗證性試驗，與理論預測值相比較，以驗證優化結果。

1.2.6 分子量的測定

采用十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfonate polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[13]。

1）電極緩沖液：稱取3 g三羥甲基氨基甲烷（Tris aminomethane），14.4 g 甘氨酸，1 g 十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulfonate，SDS）依次溶于重蒸水中，定容至100 mL，使用時再稀釋10倍。

2）樣品緩沖液：量取1 mol/L Tris aminomethane（pH 6.8）2.5 mL，巰基乙醇 1.0 mL，10%SDS 2 mL，甘油2 mL，0.1%溴酚藍1.0 mL，重蒸水3.5 mL，混勻。

3）脫色液：甲醇，冰醋酸，重蒸水按 3 ∶1 ∶6（體積比）配制。

4）分離膠、濃縮膠按表3配制。

1.2.7 超濾分離

采用超濾分離設備對酶解液進行超濾分離，使用分子量分別為10 kDa和3 kDa的濾膜。在室溫操作條件下，得到分子量大于 10 kDa，10 kDa～3 kDa，小于 3 kDa的酶解液組分，并測定ACE的抑制率和IC50值。

1.2.8 各組分IC50值的測定

稱取一定質量的各組分樣品分別配成不同質量濃度的溶液，以質量濃度為橫坐標，ACE抑制活性為縱坐標繪制曲線，根據曲線回歸方程計算出IC50值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、加酶量6 000 U/g，底物濃度2%的酶條件下，根據堿性蛋白酶的最適溫度50℃～60℃之間。酶解溫度選擇40℃～65℃，探究在這個溫度段下，核桃酶解液ACE抑制率的變化。結果如圖1所示。

由圖1可知，在一定溫度范圍內，ACE抑制率隨著酶解溫度的升高而增高，當溫度為50℃時，ACE抑制率達到54.12%。酶解溫度繼續升高，酶的結構發生改變，從而酶失活使酶活力降低，ACE抑制率也隨之降低。

2.1.2 酶解pH值對ACE抑制率的影響

在酶解溫度50℃，加酶量6 000 U/g，底物濃度2%的酶解條件下，酶解pH選擇8～10，探究在這個pH值段下，核桃酶解液ACE抑制率的變化。結果如圖2所示。

圖1 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibition

圖2 酶解pH值對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibition

從圖2可知，在一定的pH值范圍內，核桃蛋白酶解液的ACE抑制率呈現上升趨勢，當pH值為9.0時ACE抑制率最高，達到55.31%，隨著pH值繼續升高，ACE抑制率下降。是因為pH值過高使得酶失活進而影響酶的作用效果。

2.1.3 加酶量對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、溫度50℃、底物濃度2%，分別研究了加酶量5 000 U/g～10 000 U/g的酶解效果，結果如圖3所示。

圖3 加酶量對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis addition on ACE inhibition

從圖3可知，隨著酶量的增加，ACE抑制率也在增加，當加酶量為7 000 U/g時，ACE的抑制率為57.23%。當加酶量高于7 000 U/g時，ACE抑制率趨于平緩。可能由于酶濃度較低時，酶分子所能結合的底物少，而酶量增加后，酶分子所能結合的底物增加，ACE抑制率增大；而過量的蛋白酶沒有底物相結合，使ACE抑制率變化不大，最有可能是多余的蛋白酶，把部分具有ACE抑制活性的小肽被降解為活性更小的肽或者氨基酸，從而降低對ACE抑制性[14]。

2.1.4 底物濃度對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、溫度50℃、加酶量6 000 U/g，分別考察了底物濃度為1%～6%的酶解效果，結果如圖4所示。

圖4 底物濃度對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of substrate concentrations on ACE inhibition

由圖4可以看出，隨著底物濃度的增加，酶解液ACE抑制率先呈現上升的趨勢而后又下降。當底物濃度為2%時，抑制率可達到55.98%。在一定濃度范圍內，底物與蛋白酶能夠充分的結合，使ACE抑制率升高，但是底物濃度過高時，造成水解液黏度變大，阻礙了酶的擴散，對反應有抑制作用，但是過低的底物濃度，使酶解液體積增大，后續工作量也會加大[15]。

2.2 響應面模型的建立

Box-Behnken響應面試驗設計結果見表4。

表4 Box-Behnken響應面試驗設計結果Table4 The results of Box-Behnken response surface design

續表4 Box-Behnken響應面試驗設計結果Continue table 4 The results of Box-Behnken response surface design

采用響應曲面統計方法對試驗數據進行擬合，建立ACE抑制率與酶解pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度的四因子的數學二次多項回歸方程：

響應曲面數據的方差分析結果見表5。

表5 Box-Behnken響應面試驗方差分析Table5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

續表5 Box-Behnken響應面試驗方差分析Continue table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

表5分析結果顯示，方程模型的P＜0.000 1，表明該方程模型極顯著。模型失擬項P=0.064＞0.05，差異不顯著，表明響應面試驗結果和數學模型擬合良好。因此，可以使用該數學模型對試驗結果進行分析。一次項中D影響極顯著（P＜0.000 1）、交互項中AB影響顯著（P=0.039 9＜0.05），二次項中 A2、B2、C2、D2均極顯著（P＜0.000 1）。各因素對核桃酶解液ACE抑制率的影響由大到小依次為 D＞C＞A＞B。

響應面分析圖見圖5～圖10。

圖5 Y=（fA，B）的響應面圖Fig.5 Response surface of Y=f（A，B）

圖6 Y=f（A，C）的響應面圖Fig.6 Response surface of Y=f（A，C）

圖7 Y=f（A，D）的響應面圖Fig.7 Response surface of Y=f（A，D）

圖8 Y=（fB，C）的響應面圖Fig.8 Response surface of Y=f（B，C）

圖9 Y=f（B，D）的響應面圖Fig.9 Response surface of Y=f（B，D）

圖10 Y=f（D，C）的響應面圖Fig.10 Response surface of Y=f（D，C）

由圖5～圖10的響應面分析，除了AB交互項水解度的影響顯著，其余交互項對酶解液ACE抑制率的影響都不顯著。由方程分析預測得到最佳條件組合為：溫度 55℃、pH 9.03、加酶量 7 299.03 U/g底物、底物濃度2.71%。此時，模型預測的核桃蛋白酶解液ACE的抑制率為59.71%。

2.3 驗證試驗

為驗證響應面優化法所得的結果的準確性，采用上述條件進行核桃降血壓肽的制備，但考慮到實際操作的簡便性，將參數修正為溫度55℃、pH 9.0、加酶量7 300 U/g底物、底物濃度2.7%。進行3組平行試驗，此時核桃蛋白酶解產物的ACE抑制率的平均值為60.23%，與模型預測值的相接近。說明該模型能夠較好地預測實際核桃蛋白酶解液ACE抑制率情況。

2.4 酶解液分子量分布的測定結果

核桃蛋白酶解物的凝膠電泳圖見圖11。

圖11 核桃蛋白酶解物的SDS-PAGEFig.11 SDS-PAGE of the hydrolysate of walnut protease

參照標準Marker蛋白，核桃蛋白的分子量主要在60 kDa以內，核桃蛋白酶解物分子量主要分布在35 kDa以下。

2.5 超濾分離組分抑制率的IC50值比較

表6為超濾分離試驗不同組分的ACE抑制活性和IC50測定結果。

表6 超濾分離組分抑制率的IC50值比較Table6 Comparison of the IC50value of the inhibitory rate of ultrafiltration separation components

由表6可以看出，經過超濾分離，分子量越小的組分IC50值越低，其ACE抑制活性越高。小于3 kDa超濾液的IC50值比 3 kDa～10 KDa超濾液降低了0.6046mg/mL，比原酶解液IC50值降低了2.1885mg/mL。這也初步說明具有ACE抑制活性的核桃蛋白肽分子量在3 kDa以下。

3 結論

基于單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平的響應面分析法對核桃蛋白酶解進行優化。將優化所得最佳酶解條件調整為：溫度55℃、pH 9.0、加酶量7 300 U/g底物、底物濃度2.7%，在此工藝條件下進行3次重復驗證性試驗，實際測得核桃蛋白酶解產物的ACE抑制率的平均值為60.23%。經超濾分離得到小于3 kDa核桃降血壓肽的的IC50值最低為0.389 3 mg/mL，其ACE抑制活性最高。本研究為酶法制備降血壓肽提供理論依據，并為核桃蛋白進一步開發利用提供實踐基礎。