梵凈山藤茶黃酮含量分析及其復合飲料的加工工藝

謝勇，劉慶慶，盧忠英，姚元勇，高健強

（1.銅仁學院材料與化學工程學院，貴州銅仁554300；2.貴州省梵凈山特色動植物資源重點實驗室，貴州銅仁554300）

藤茶（Ampelopsis grossedentata），學名顯齒蛇葡萄，亦稱“白茶”等，屬葡萄科多年生木質藤本植物，是我國特有的珍稀藥食兩用植物資源[1]。該物種在銅仁區域主要分布于武陵山脈主峰梵凈山南側的江口和石阡兩縣等地。研究表明，藤茶中可溶性蛋白質約0.55%、氨基酸總量2.53%、非必需氨基酸總量1.8%，熱水浸提物中總黃酮含量19.3%～33.5%、其中二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）單體含量達 14%～30.6%，是藤茶的主要活性成分[2-4]。研究表明，DMY有抗氧化[5]、降低大鼠脫氧皮酮鹽性高血壓[6]、抑制小鼠血糖升高[7-8]、降低小鼠高脂血[9]及抗血栓[10]功效，金銀花（Lonicera japonica）中的綠原酸等有機酸有體外抗（adenosine aiphosphate，ADP）誘導的血小板聚集作用[11]、絞股藍（Gynostemma pentaphyllum Makino）具有明顯延長凝血時間的作用[12]、且研究發現絞股藍總皂苷具有抑制小鼠血小板血酸及靜脈血酸形成的作用[13-14]。丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）含有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等水溶性成分[15]，其中丹參素具有抗血小板聚集及抑制血小板二硫鍵異構酶ERp57與整合素αⅡbβ的相互作用[16]。由此可知，金銀花、絞股藍及丹參均對血栓及其他心血管疾病有一定的防護功效。

功能性飲料主要包括運動飲料、營養素飲料及其他特殊飲料3類。而中國功能性飲料主要以茶劑、沖劑及酒劑為主[16]。資料顯示，金銀花、絞股藍及丹參藥食兩用植物已被注冊為功能性飲料的原料，且已有35個以上以藥食兩用植物為配方的功能性飲料產品，其功效/標志性成分以總皂苷、總黃酮及粗多糖居多，占總功效成分種類的83.87%[17]。目前，關于藤茶功能性飲料的研究較少，主要有藤茶一般性飲料[18]、藤茶復合飲料[19]，未有功能明確的藤茶功能性飲料研究報道。研究進一步發現，藤茶中的DMY在動物體內易消化，且代謝迅速[20]。

以藤茶、金銀花、絞股藍及丹參為主要原料，先分析梵凈山不同區域藤茶中黃酮的含量，再添加適量輔料以制備藤茶復合飲料，并考察各組分對飲料黃酮含量及感官品質的影響，為藤茶功能性復合飲料的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

Alpha-1860A紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司；TP310酸度計：北京時代新維測控設備有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：常州普天儀器制造有限公司；NAI-ZFCDY-2Z脂肪測定儀：上海那艾精密儀器有限公司；SRH-S均質機：上海世赫機電設備有限公司。

1.2 主要材料與試劑

藤茶：貴州省銅仁學院藤茶種植基地（分別引種自梵凈山區域江口縣桃印鎮和德旺鎮、松桃縣寨英鎮）；金銀花、絞股藍及丹參：市售；二氫楊梅素（純度＞98%）：吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室；果葡糖漿（食品級）：上海根菜食品有限公司；檸檬酸（AR）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶復合飲料的制備

將采摘的新鮮藤茶殺青（100℃）15 min，40℃烘箱中干燥并粉碎，備用。稱取一定量的藤茶粉、金銀花、丹參、絞股藍，分別置于燒杯中并按100∶1（mL/g）的比例加入蒸餾水，于75℃水浴鍋中浸提40 min，抽濾除濾渣，按一定配比合并濾液，之后加入果葡糖漿等輔料，經超聲脫氣（5 min）、均質（5 min）、微波滅菌（3 min）、冷卻后灌裝，得成品。

1.3.2 藤茶復合飲料的感官評定標準

由具有食品專業背景的10人，從飲料的色澤、口感、氣味、組織狀態4個方面綜合評價，評價標準如表1所示。

表1 藤茶復合飲料感官評價標準Table1 Criteria for sensory evaluation of Ampelopsis grossedentata compound beverage

1.3.3 理化指標的測定

黃酮含量的測定：標準品DMY的濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL，先用紫外可見分光光度計對標準液進行全波長掃描以確定最大吸收波長，然后根據標準液濃度和標準溶液的ODmax制作標準曲線。將干燥藤茶葉浸提液稀釋一定倍數后于最大吸收波長處測定OD值，并計算藤茶中黃酮的含量；pH的測定：pH計直接測定；可溶性糖的測定：蒽酮-硫酸法[21]；粗蛋白含量的測定參照文獻[22]；粗脂肪含量的測定：國標酸水解法[23]。

1.3.4 不同產地藤茶中黃酮含量（干重）的分析

分別采摘梵凈山3個不同區域的藤茶，第一次采摘時間為2016年4月16日（約發芽一周后），隨后每隔約一周采摘一次。將采摘后的新鮮藤茶葉按照1.3.1的方法進行處理，干燥后稱取1 g，并按照1.3.3的方法測定總黃酮的含量。

1.3.5 不同組分對藤茶中黃酮含量的影響

為了探究飲料中不同組分對藤茶功能性成分黃酮含量的影響，于5支試管加入2 mL 0.002 mg/mL DMY標品，再分別添加2 mL藤茶、金銀花、絞股藍及丹參的浸提液和蒸餾水，混合均勻后按照1.3.3的方法測定黃酮含量。

1.3.6 單因素試驗

以30mL藤茶汁為基準，添加β-環糊精0.3mg/mL、食鹽0.5 mg/mL、VC0.02 mg/mL，考察不同因素對藤茶復合飲料感官品質的影響：金銀花浸提液5、10、15、20、25mL，其它恒定條件為，絞股藍10 mL、丹參10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；絞股藍浸提液5、10、15、20、25 mL，其它恒定條件為，金銀 10 mL、丹參10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；丹參浸提液 5、10、15、20、25 mL，其它恒定條件為，金銀花10 mL、絞股藍10 mL、檸檬酸0.6 mg/mL、果葡糖漿0.08 g/mL；檸檬酸 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，其它恒定條件為，金銀花、絞股藍及丹參各10 mL，果葡糖漿0.08 g/mL；果葡糖漿 0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g/mL，其它恒定條件為，金銀花、絞股藍及丹參各10 mL，檸檬酸0.6 mg/mL。

1.3.7 藤茶復合飲料工藝的優化

根據單因素試驗結果，確定丹參浸提液添加量10 mL，采用正交試驗優化藤茶復合飲料的工藝配方，因素水平編碼如表2所示。

表2 藤茶復合飲料工藝優化試驗因素水平表Table2 Factors and their levels of technology optimization experiments for Amplelopsis grossedentata compound beverage

1.4 數據處理與分析

采用“IBM SPSS 22.0”軟件和“Origin”軟件對單因素數據進行處理，正交試驗采用“正交設計助手V3.1”軟件處理。

2 結果與分析

2.1 黃酮含量標準曲線

經測定，得DMY的最大吸收波長λ為326 nm。黃酮含量的標準曲線回歸方程為：Y=47.834X+0.006 4，R2=0.998 9，其中X為DMY的濃度（mg/mL），Y為OD326。

2.2 不同區域藤茶中黃酮含量的分析

在不同時期，測定了梵凈山不同區域藤茶（干重）的黃酮含量，結果如圖1所示。

由圖1可知，在藤茶發芽初期（4月16日左右），江口桃印藤茶黃酮含量最高，為（24.1±0.21）%，江口德旺的最低，為（21.1±0.25）%；隨著時間的增加，不同區域藤茶的黃酮含量均在增加，其中江口桃印藤茶的增幅平緩，江口德旺藤的增幅較大，到5月6日左右時，江口德旺藤茶黃酮的含量最高，為（40.3±0.53）%，江口桃印藤茶的含量最低，為（27.4±0.08）%。由此可知，梵凈山不同區域藤茶的黃酮含量在不同生長時期是有差別的，且成熟期的差異最明顯。

圖1 梵凈山不同區域藤茶中總黃酮的含量Fig.1 Content of flavone of Amplelopsis grossedentata from different regions of Fanjing mountain

表3 不同組分對藤茶黃酮含量的影響Table3 Effect of different components on flavone content from Amplelopsis grossedentata

表4 不同組分添加量對藤茶飲料品質的影響Table4 Effect of addition of Flos Lonicerae extraction on quality of Amplelopsis grossedentata beverage

2.3 不同組分對藤茶飲料中總黃酮含量的影響

考察了金銀花、絞股藍及丹參3種浸提組分對藤茶飲料黃酮含量的影響，結果如表3所示。

由表3可知，3種不同組分不會降低藤茶中黃酮的含量，而是增加了飲料中黃酮的含量。原因可能是，3種組分中含有少量或微量黃酮類化合物；藤茶飲料中的各組分在加熱及均質等條件下發生了絡合或包埋作用，使得總黃酮含量增加。而研究也表明，絞股藍、金銀花及丹參均含有黃酮、異黃酮及雙氫黃酮等黃酮類物質[24-26]；梁曉慶等[27]測定得絞股藍中總蛋白含量為100 mg/mL～238 mg/mL，而這些蛋白質在加熱條件下可通過自組裝的方式將藤茶中的黃酮進行包埋，從而增強了黃酮的溶解度[28]。

2.4 不同組分對藤茶飲料品質的影響

考察了金銀花浸提液、絞股藍浸提液及丹參浸提液對藤茶飲料感官品質的影響，結果如表4所示。

當金銀花汁添加量為20 mL時，感官評分最高，為85.2分；且金銀花和絞股藍對飲料的感官品質有顯著影響。原因可能是金銀花中與金銀花氣味顯著相關的揮發性成分綠原酸、木犀草苷及多酚類增加了飲料的清香味[29]；金銀花中酚酸類、黃酮及環烯醚萜類物質使其浸提液色澤鮮亮[30]；絞股藍具有飲后回甜的作用，適量添加可改善藤茶飲料的口感，但添加量過高，絞股藍的藥效成分總苷中的苦味皂苷含量高于甜味皂苷[31-32]，使得飲料口感苦澀，感官品質變差。丹參對藤茶復合飲料的氣味有一定的影響，但對其他品質的影響較小（P=0.064）。

2.5 檸檬酸添加量對藤茶復合飲料品質的影響

考察了檸檬酸用量對藤茶復合飲料的品質的影響，結果如表5所示。

表5 檸檬酸添加量對藤茶復合飲料品質的影響Table5 Effect of citric acid addition on qualities of Amplelopsis grossedentata beverage

由表5可知，檸檬酸對藤茶復合飲料感官評分的影響顯著。檸檬酸添加過量或不足均不利于飲料口感的改善。原因可解釋為，檸檬酸作為酸味劑，無揮發性、色澤白色，對飲料的氣味、色澤無明顯影響，但可與飲料中的葡萄糖、果糖及有機酸通過味的協同作用或拮抗作用，使飲料的酸味醇厚；另外，檸檬酸可結合金屬離子，防止金屬離子造成異味[3]。

2.6 果葡糖漿添加量對藤茶復合飲料品質的影響

考察了果葡糖漿對藤茶復合飲料品質的影響，結果如表6所示。

表6 果葡糖漿添加量對藤茶復合飲料的影響Table6 Effect of fructose ayrup addition on qualities of Amplelopsis grossedentata beverage

由表6可知，果葡糖漿對藤茶復合飲料的品質有顯著影響。可能是因為果葡糖漿是藤茶復合飲料甜味的最主要來源。果葡糖漿中果糖等甜味物質與飲料中的有機酸等成分通過味的協同作用形成適宜的酸甜比，使飲料的口感細膩而醇厚。

2.7 藤茶復合飲料工藝優化及結果

單因素試驗方差分析如表7所示。

表7 單因素試驗方差分析Table7 Variance analysis of single factor experiments

根據單因素試驗結果，除丹參外其它幾個因素的影響均顯著。因此，選擇四因素三水平正交試驗設計對絞股藍用量（A）、金銀花用量（B）、檸檬酸用量（C）及果葡糖漿用量（D）4個因素進行優化，因素水平如表2所示，試驗結果如表8所示。

表8 正交試驗設計及結果Table8 Design and results of orthogonal test

據表8得藤茶復合飲料最佳配方為A1B1C0D0，即藤茶30 mL，絞股藍20 mL，金銀花25 mL，檸檬酸0.06 mg/mL，果葡糖漿0.08 g/mL。經3次驗證試驗，感官評分為（88.5±0.5）分，結合正交試驗數值，可知此配方最優，效果最好。所得到藤茶復合飲料色澤棕黃、氣味清香、組織透明、酸甜適中、口感細膩、無懸浮物、無異味，具有藤茶復合飲料特有的風味。

2.8 理化指標

經測定，藤茶復合飲料中黃酮含量0.15 g/mL、pH值為5.6、可溶性糖含量為0.092 g/mL、粗蛋白含量為0.67mg/mL、粗脂肪未檢出。

3 結論

1）梵凈山不同區域藤茶中黃酮含量（干重）在藤茶不同生長時期存在差異，江口德旺最高，為（40.3±0.53）%，且丹參、金銀花及絞股藍均可增加藤茶復合飲料中黃酮的含量。

2）藤茶復合飲料的最佳配方為：30 mL藤茶、20 mL絞股藍、25 mL金銀花、10 mL丹參、0.06 mg/mL檸檬酸、0.08 g/mL果葡糖漿、0.5 mg/mL食用鹽、0.02 mg/mL VC、β-環糊精0.3 mg/mL，此條件下感官評分最高，為（88.5±0.5）分。

3）藤茶復合飲料中總黃酮含量為0.15 g/mL，pH值5.6，可溶性糖含量為0.092 g/mL，粗蛋白含量為0.67 mg/mL，粗脂肪未檢出。所得藤茶復合飲料呈棕褐色、氣味清香、組織透明、酸甜適中、口感細膩、無懸浮物、無異味，具有藤茶復合飲料特有的風味。