4種胡椒科植物粗提物對灰葡萄孢的抑菌活性

祁之秋 李修偉 紀(jì)明山

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，遼寧沈陽 110161）

灰霉病是近年來保護地番茄、黃瓜、草莓等作物上的重要病害，發(fā)生時間早、持續(xù)時間長、傳播速度快，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時可減產(chǎn)50%以上（陳茂春，2018）。能否及時有效地防治灰霉病是番茄生產(chǎn)中的重要問題。化學(xué)防治是控制灰霉病的主要手段，但隨之帶來的抗藥性、再猖獗、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題越來越引起人們的關(guān)注。從植物中尋找活性物質(zhì)是開發(fā)新農(nóng)藥的重要方法，植物源農(nóng)藥也成為國內(nèi)外研究的熱點之一（張興等，2015）。胡椒科植物蓽茇、黑胡椒、白胡椒等是中蒙藏醫(yī)常用藥物（呼日樂巴根，2009）。本文測定了蓽茇、假蒟、黑胡椒、白胡椒4種胡椒科植物粗提物對灰葡萄孢的抑菌活性，旨在為植物源抑菌農(nóng)藥新資源的尋找和發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌：灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers），由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥科學(xué)實驗室提供。

供試植物：蓽茇（Piper longum L.）、假蒟（Piper sarmentosum Roxb.）、黑胡椒（black pepper）及白胡椒（white pepper），購于中藥材市場。

化學(xué)藥劑：98.2%嘧霉胺（pyrimethanil）原藥購于昆山瑞澤農(nóng)藥股份有限公司，稱取0.105 1 g原藥，用丙酮定容到10 mL，配得10 000 mg·L-1母液，作為藥劑對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物粗提物的提取 分別將4種供試植物粉碎，過60目篩；稱取500 g（DW），用95%乙醇提取3次，加入的乙醇量分別為400、200、200 mL，每次提取48 h，合并萃取濾液；50 ℃減壓濃縮得粗浸膏物，以乙醇為溶劑，配成1 g·mL-1活性物質(zhì)提取物。

1.2.2 植物粗提物對灰葡萄孢菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法測定植物粗提物對灰葡萄孢的抑制作用。用乙醇將植物粗提物與PDA培養(yǎng)基混合，配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1的含藥培養(yǎng)基，每個處理均以只加入乙醇的培養(yǎng)基為對照（CK0）。將嘧霉胺與PDA培養(yǎng)基混勻，制成最終濃度為128、32、8、2、1 μg·mL-1的含藥平板，作為對照藥劑（CK1）。每處理3次重復(fù)。將直徑5 mm的灰葡萄孢菌餅接種于平板中央，25 ℃下培養(yǎng)4 d。測量菌落直徑，求得每種植物提取物對灰葡萄孢的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50。

1.2.3 植物粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響 按照1.2.2的方法，配制植物粗提物及對照藥劑的含藥培養(yǎng)基，各處理濃度均設(shè)定為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，接種灰葡萄孢菌餅。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃恒溫箱，培養(yǎng)至產(chǎn)孢（約25 d）。每平板距菌落邊緣相等處挑取5個菌碟（φ=1 cm）放入空滅菌離心管中，加入2 mL無菌水，振蕩沖洗1 min。在40倍顯微鏡下，利用血球計數(shù)板記錄孢子數(shù)，每處理4次重復(fù)（Rod ír gueza et al.，2011）。

1.2.4 植物粗提物對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響 取PDA平板上已產(chǎn)孢的灰葡萄孢菌，用無菌水配制孢子懸浮液（1×104個·mL-1），取20 μL滴在凹玻片上，再分別滴加20 μL不同稀釋倍數(shù)的植物粗提液和對照藥劑，使每處理濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1。混勻后置于25 ℃下培養(yǎng)12 h，以只加入乙醇的培養(yǎng)基為對照（CK0），每處理4次重復(fù)，在顯微鏡下觀察并記錄萌發(fā)孢子數(shù)，計算不同濃度植物粗提物對分生孢子萌發(fā)的抑制率。

1.2.5 植物粗提物對灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響 按1.2.2的方法將灰葡萄孢接入含系列濃度粗提物的PDA平板中，25 ℃下培養(yǎng)25 d，觀察在不同濃度的4種植物粗提物PDA平板上是否有菌核產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物粗提物對灰葡萄孢菌絲生長的影響

胡椒科4種植物對灰葡萄孢菌絲生長均有較強的抑制作用。當(dāng)各處理濃度為0.5 g·mL-1時，蓽茇提取物對灰葡萄孢菌絲生長的抑制率最高，達(dá)到91.8%，其次是白胡椒和黑胡椒提取物，分別達(dá)到86.4%和50.8%，假蒟提取物的抑制率僅為36.8%。從表1中可以看出，蓽茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒對灰葡萄孢的EC50分別為0.032 2、0.883 2、0.398 0、0.007 9 g·mL-1。但 4種胡椒科植物粗提物對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用明顯低于嘧霉胺。

表1 植物粗提物對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用

2.2 植物粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響

相同濃度下，蓽茇、假蒟粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用較強，其次為白胡椒，黑胡椒抑制作用較低（表2）。當(dāng)濃度為0.5 g·mL-1時，蓽茇、假蒟和白胡椒粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制率分別為92.8%、92.0%和82.8%，而黑胡椒粗提物的抑制率僅達(dá)58.8%；當(dāng)濃度為0.062 5 g·mL-1時，蓽茇和假蒟對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用仍達(dá)60%以上。但植物粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用遠(yuǎn)小于化學(xué)藥劑嘧霉胺。

表2 植物粗提物對灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響

2.3 植物粗提物對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

4種植物粗提物對灰葡萄孢孢子萌發(fā)有強烈的抑制作用（表3）。相同濃度下，黑胡椒和白胡椒粗提物對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用強于蓽茇和假蒟，當(dāng)濃度為0.031 25 g·mL-1時，二者對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制率仍高于65%，而蓽茇和假蒟粗提物對孢子萌發(fā)的抑制率不到30%。對照藥劑嘧霉胺對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用最強，抑制率在98%以上。

表3 植物粗提物對灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

2.4 植物粗提物對灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響

從表4可以看出，除了0.031 25 g·mL-1假蒟粗提物對灰葡萄孢菌核無影響外；4種植物粗提物濃度高于0.062 5 g·mL-1時，均能完全抑制灰葡萄孢菌核的產(chǎn)生。

表4 植物粗提物對灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論與討論

植物源活性物質(zhì)的研究已成為當(dāng)前的熱點與趨勢，并取得了顯著的成果（張興 等，2015）。胡椒科植物多數(shù)具有藥用價值，其中的活性物質(zhì)研究也受到了廣泛的關(guān)注（孫丹 等，2008；Gulzar et al.，2013）。本試驗結(jié)果表明，胡椒科植物蓽茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒的乙醇粗提物對灰葡萄孢發(fā)育的各階段都有較強的抑制作用。白胡椒乙醇提取物對菌絲生長的抑制作用最強，EC50為0.007 9 g·mL-1，其次為蓽茇、黑胡椒和假蒟。孫丹等（2008）的研究表明，假蒟和草胡椒的粗提物對8種植物病原菌菌絲生長具有抑菌活性，與本試驗結(jié)果一致。盡管采用乙醇萃取植物中次生代謝產(chǎn)物已有許多報道（魯世偉 等，2010；閆紅豆 等，2014；陳楚英等，2016），但因溶劑單一，可能會導(dǎo)致植物中某些活性成分漏篩。為提高活性物質(zhì)產(chǎn)量和防止活性物質(zhì)漏篩，可進一步選用不同極性的有機溶劑萃取活性物質(zhì)。本試驗中胡椒科4種植物提取物對灰葡萄孢生長發(fā)育各階段的抑制作用均小于化學(xué)藥劑嘧霉胺，這是因為本試驗中的植物提取物為粗提物，其中殺菌活性成分含量較低，而這些有效成分具有強烈的抗菌活性。分離這些活性物質(zhì)并鑒定其分子結(jié)構(gòu)，有可能發(fā)現(xiàn)具有新型殺菌活性、新型作用機制的先導(dǎo)化合物，為胡椒科植物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。